雷公藤乙素及其類似物對糖尿病腎病大鼠腎臟中轉化生長因子β1的影響

臧立輝 王亞娟 曲有樂

浙江海洋學院，浙江 舟山 316000

雷公藤系衛矛科雷公藤屬植物，其藥用部位是該植物的根及莖［1，2］，其抗炎、免疫抑制等活性作用的主要成分是雷公藤二萜內酯類［3］。近年來雷公藤類藥物廣泛應用于糖尿病及其并發癥的研究，而DN是糖尿病主要微血管并發癥之一。研究顯示，TGF－β1在DN的發生和發展過程中起到非常重要的作用［4］，其被認為是腎小球硬化和腎小管間質纖維化機制中最關鍵的細胞因子。另有證據表明，TGF－β1參與了DN的產生與發展［5］，并將血液中TGF－β1作為糖尿病腎病早期診斷敏感指標。本實驗擬通過有效控制TGF－β1的含量，影響DN大鼠腎組織修復，探討雷公藤乙素及其類似物對DN的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

1.1.1 SD大鼠

清潔級雌雄SD大鼠60只，購于浙江省醫學科學院，體重130g±10g，批號:0016453。

1.1.2 主要試劑

雷公藤甲素和雷公藤乙素 (上海雅吉生物科技有限公司，批號:07111G和YS0105，使用時用生理鹽水配置成濃度為0.025mg/ml的溶液，4℃保存)。鏈脲佐菌素 (STZ美國Sigma公司產品，批號:31087，用前溶解在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH值為4.5)。TGF－β1酶聯免疫試劑盒 (北京博奧森生物技術有限公司，批號:201109)。

1.1.3 主要儀器

酶標儀 (美國伯樂型酶標儀HB.63－BIO－RAD680)，離心機 (LD5－2A臺式低速離心機)，OLYMPUS光學顯微鏡 (SZ61體視顯微鏡)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DN大鼠模型的建立

普通飼料喂養四周后，按體重隨即抽取12只大鼠作為空白實驗組。其余48只按60mg/kg一次性腹腔注射3%STZ溶液，一周后尾靜脈采血測定空腹血糖及尿量，將血糖≥16.7mmo1/L，尿量大于空白實驗組的50%作為DN大鼠成模標準。

1.2.2 實驗動物分組及給藥

造模后的DN大鼠按體重隨即分為四組，每組11只，分別為實驗對照組、雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組、雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組、纈沙坦治療組。DN大鼠按雷公藤乙素及其類似物200ug/kg.d、纈沙坦20mg/kg.d每日灌胃給藥，連續給藥12周。實驗期間自由飲水，進食普通飼料。

1.2.3 動物處理方法及指標檢測

連續給藥12周后，一次性處死大鼠，同時解剖大鼠，收集腎臟標本。用常規病理切片HE染色法光鏡下分析各組大鼠腎臟損傷的修復程度，用ELISA雙抗夾心法檢測大鼠腎組織和血清中TGF－β1的實際含量。

1.2.4 統計學方法

2 結果

2.1 實驗中DN大鼠的一般情況

造模后，DN大鼠出現尿量明顯增多，飲水量和飲食量明顯增大的情況，體重明顯降低，行為活動遲緩、毛色變暗、無光澤、體態消瘦等狀況，給藥六周后出現弓背、白內障等糖尿病并發癥。

2.2 ELISA雙抗夾心法檢測結果

圖1 ELISA雙抗夾心法檢測DN大鼠腎組織內TGF－β1標準曲線

治療12周后處死大鼠并收集血清、腎臟標本。嚴格按照TGF－β1ELISA試劑盒實驗說明操作步驟操作，繪制標準曲線 (R＞0.92)，見圖1，并通過標準曲線計算DN大鼠腎臟和血清中的TGF－β1的含量。結果表明:空白實驗組中大鼠腎組織TGF－β1的含量顯著低于實驗對照組 (P＜0.05)，且也明顯低于雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組和纈沙坦治療組 (P＜0.01)，而與雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組并無明顯差異 (P＞0.05);實驗對照組DN大鼠腎組織TGF－β1的含量顯著低于雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組和纈沙坦治療組 (P＜0.01)，而與雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組并無明顯差異 (P＞0.05);雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組與纈沙坦治療組之間DN大鼠腎組織TGF－β1的含量并無明顯差異 (P＞0.05)，但均明顯高于雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組 (P＜0.01)，見表1。

空白實驗組大鼠血清中TGF－β1的含量明顯高于造模各組 (P＜0.01);實驗對照組DN大鼠血清中TGF－β1的含量明顯低于各治療組 (P＜0.01);雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組DN大鼠血清中TGF－β1的含量顯著低于雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組 (P＜0.05)，明顯高于纈沙坦治療組 (P＜0.01);雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組DN大鼠血清中TGF－β1的含量明顯高于纈沙坦治療組 (P＜0.01)，見表1。

表1 ELISA雙抗夾心法大鼠腎臟、血清中TGF－β1的實際濃度

2.3 HE 染色結果

2.3.1 造模成功組與實驗對照組

腎臟皮質變薄，皮髓質界限不清，腎小球數目明顯減少，殘余腎小球不同程度纖維化，腎小管萎縮、纖維化，間質充血、出血，隨著病程的進展大鼠出現持續蛋白尿、水腫和腎功能不全、尿毒癥等癥狀，圖2－A。

2.3.2 空白實驗組

腎臟皮髓質界限清楚，腎小球和腎小管結構正常，間質輕度淤血 (處死大鼠時造成腎臟間質輕度淤血)，圖2－B。

圖2 各組大鼠腎臟病理HE染色圖

2.3.3 雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組

腎臟皮質比治療前明顯增厚，腎小球結構基本正常，腎小管管腔完整，腎小管上皮細胞輕度水腫，間質無纖維組織增生，圖2－C。

2.3.4 雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組

腎臟結構明顯恢復，多數腎小球結構基本正常，腎小管上皮細胞輕度體積較大，部分腎小管上皮細胞呈現空泡變性，間質輕度充血，無明顯纖維組織增生，圖2－D。

2.3.5 纈沙坦治療組

腎臟部分結構恢復明顯，部分腎小球結構恢復正常，少數腎小球呈現不同程度纖維化，腎小管上皮細胞輕度水腫，部分管腔內見顆粒管型，間質輕度充血，有少量纖維組織增生，圖2－E。

對比各組大鼠腎臟標本的病理切片，通過光鏡觀察顯示實驗結果表明:雷公藤乙素+雷公藤甲素聯合治療組腎臟結構恢復優于雷公藤乙素+纈沙坦聯合治療組和纈沙坦治療組。

3 討論

DN是糖尿病 (DM)嚴重的慢性并發癥之一，也是DM患者重要的死亡原因。DM確切發病機制仍未完全闡明，既往的研究主要集中在血糖和血脂代謝紊亂等方面。本實驗主要研究TGF－β1在DN的發生、發展中起著重要的影響及生物學作用。

研究表明［6］，中藥對腎組織糖代謝紊亂、糾正脂代謝紊亂、改善微循環、調節細胞因子方面均有一定優勢，經雷公藤乙素及其類似物治療后，DN大鼠腎臟修復明顯。有證據表明引起DN發生的原因不僅與糖基化終末產物對腎小球的毒性作用和血管緊張素Ⅱ等因素有關，而且與生長因子TGF－β等的作用有關［7］。在ELISA雙抗夾心法檢測到雷公藤乙素及其類似物治療后DN大鼠腎組織中TGF－β1含量明顯減少，是由于TGF－β1是一種調節細胞生長和分化的多肽，對腎小球細胞和細胞外基合成膠原蛋白，纖維連接蛋白、粘多糖、透明質酸等具有增多作用［8］。因此合理控制TGF－β1的含量，可以對腎組織起到有效的修復和保護作用;而雷公藤乙素和雷公藤甲素治療組DN大鼠血清中TGF－β1含量明顯高于其他各治療組，是由于TGF－β1是由血管內皮生長因子 (VEGF)促進生成的血管內皮細胞和腎小球系膜細胞產生的，其作用還可誘導其表達，血清中TGF－β1的高含量更能對血管的生長和微血管通透性起到了修復和保護的作用。

綜上所述，雷公藤乙素及其類似物能調節大鼠腎組織糖代謝紊亂，達到降低血糖和尿量的作用，并通過對TGF－β1的有效控制，對DN大鼠的腎臟的修復起到明顯的作用，從而達到治愈DN的效果。

［1］蘇維廣，孟江.雷公藤的臨床應用 ［J］.遼寧中醫雜志，2003，30(10):845—846.

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［5］Ziyadeh FN，Han DC，Cohen JA，et al.Glycated albumin stimulates fibronectin gene expression in glomerular mesangial cells:involvement of the transforming growth factor－β system ［J］.Kidney Int.1998，53(3):631－636.

［6］朱榮寬，李靖.中醫藥防治糖尿病腎病研究進展［J］.中國社區醫師雜志，2011，30(13):199.

［7］李偉民，徐 魁，余亞娟，等.TGF－β1在糖尿病腎病中的含量檢測［J］.咸寧學院學報 (醫學版)，2004，18(1):30－32.

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