稀薟上雙生病毒的分子鑒定技術(shù)研究

董志輝

(遼寧省沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)220101)

1 引言

粉虱傳雙生病毒(Whitefly transmitted geminivirus，WTG)是一類(lèi)廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)植物上的具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈DNA病毒。在分類(lèi)上屬雙生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)。該屬的大多數(shù)病毒是雙組份雙生病毒，其基因組為兩條長(zhǎng)度相似(每條約2.8kb)的閉合環(huán)狀ssDNA分子，分別為DNA－A和DNA－B。少數(shù)病毒為單組分雙生病毒，僅有一個(gè)DNA－A組分［1］。目前，在亞洲和非洲等許多國(guó)家的單組份begomoviruses上發(fā)現(xiàn)了伴隨有DNAβ的病害復(fù)合體。DNAβ對(duì)于begomoviruses誘導(dǎo)典型癥狀是必需的，并可能在決定病毒寄主范圍中起重要作用，為病毒適應(yīng)更多的寄主提供了機(jī)會(huì)［2～5］。我國(guó)自 1982 年報(bào)道［6］發(fā)現(xiàn)雙生病毒以來(lái)，在云南、海南、廣西、和廣東等18省區(qū)的番茄、番木瓜、煙草和番薯等已相繼發(fā)現(xiàn)多種雙生病毒［7～11］。雙生病毒在我國(guó)的危害日益嚴(yán)重，隨著全球氣候變暖、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境變化、煙粉虱賴(lài)以越冬的地域不斷北移以及交通、旅游、農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易全球化等因素，我國(guó)雙生病毒發(fā)生地區(qū)不斷北移，并給生產(chǎn)上造成較大的損失［12］。本文對(duì)從福建漳州稀薟(Siegesbeckia orientalis)上采集到具典型雙生病毒癥狀的樣品進(jìn)行了分子檢測(cè)，并對(duì)序列進(jìn)行了分析。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 植物樣品

2012年2月，在福建漳州地區(qū)采集到表現(xiàn)雙生病毒的典型黃脈癥狀稀薟樣品。

2.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取的稀薟病樣總DNA作為模板［13］。利用引物 PA/PB［11］(TAATATTACCKGWKGVCCSC/TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA)擴(kuò)增雙生病毒基因組DNA－A的部分序列，根據(jù)測(cè)出的序列設(shè)計(jì)引物FJ12F/R(ACAGAATGTACAAAAGCCCTGA/ATCTGCTGGTCGCTTC GACAT)擴(kuò)增近全長(zhǎng)的DNA－A，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆至pMD－18T Vector，測(cè)序。利用通用引物PCRC1/PBL1V 2040［14］(CTAGCTGCAGCATATTTACRARWATGCC/ACCTCTGCAGCARTGRTCCKATYTTCATAC)擴(kuò)增雙生病毒DNA－B組分。利用通用引物Beta01/02(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCC AGGGGTACAC)［15］擴(kuò)增雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNAβ分子。利用通用引物DNA101/102(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGTAC AC)［16］擴(kuò)增雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNA1分子。

2.3 序列分析

序列測(cè)定由上海生物工程有限公司完成。數(shù)據(jù)處理借助 DNAStar軟件(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和 DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft，Quebe Canad)進(jìn)行。利用BLAST程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與DNA－A和DNAβ序列最相近的基因組序列。采用DNAStar分析軟件(Madison，Wis.，U.S.A)中 ClustalV方法對(duì)DNA－A和DNAβ序列的核苷酸或者氨基酸的相似性進(jìn)行分析。采用Mega4.0臨近法繪制親緣關(guān)系樹(shù)，設(shè)置種子重復(fù)數(shù)是1000［17］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 病毒基因組DNA－A的分子特征

FJ12 DNA－A全長(zhǎng)2770nts，具有典型的雙生病毒基因組結(jié)構(gòu)，即編碼6個(gè)開(kāi)放讀碼框架(ORFs)，其中病毒鏈編碼AV1(CP)和AV2兩個(gè)ORFs，互補(bǔ)鏈編碼AC1(Rep)、AC2、AC3和 AC4共4個(gè) ORFs。DNA －A 還含有一個(gè)較長(zhǎng)的非編碼區(qū)，又稱(chēng)基因間隔區(qū)(Intergenic Region，IR)，并含有保守序列TAATATTAC及TATA盒(核苷酸2672－2675位)，還有重復(fù)序列GGTGTC(核苷酸2625－2631位，重復(fù)于核苷酸2654－2659位和2661－2666位，反方向重復(fù)于核苷酸2654－2659位2680－2685)，該重復(fù)序列是復(fù)制酶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

從全基因組看，相似性與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%，其次與中國(guó)番木瓜曲葉病毒PaLCuCNV的相似性較高，為76.8%。而FJ12 IR除了與稀薟黃脈病毒的同源性最高為86.8%外，與其它begomoviruses的相似性都很低，只有39.9% ～58.6%。對(duì)編碼的蛋白序列進(jìn)行比較時(shí)，F(xiàn)J12編碼的6個(gè)基因都與SbYVV的同源性最高，其中 AV1為96.6%，AV2為95.3%，AC1為97.3%，AC2 為 91.2%，AC3 為 94.0%;AC4 為93.8%(表1)。

表1 FJ12DNA－A與其他雙生病毒DNA－A核苷酸和氨基酸序列的相似性比較 %

病毒DNA-A IR AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4 TbCSV 72.2 58.6 80.9 62.6 85.0 56.0 69.4 77.3 TbLCJV 70.0 44.8 76.5 66.4 80.6 59.3 71.6 73.2 ToLCGdV 76.2 50.5 95.3 76.7 84.2 60.0 69.4 74.2 ToLCVV 75.9 55.8 95.3 73.3 84.5 56.3 61.2 76.3 TYLCCNV 72.8 54.9 80.1 68.7 83.9 57.5 74.6 78.4 SbYVV 95.7 86.8 97.3 96.6 95.3 91.2 94.0 93.8

為了進(jìn)一步明確這FJ12分離物與其它病毒的系統(tǒng)親緣關(guān)系，筆者構(gòu)建了基于DNA－A核苷酸序列的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(圖1A)。從圖上可看出，與序列比較的結(jié)果相似，F(xiàn)J12在系統(tǒng)樹(shù)上與SbYVV聚類(lèi)在一起，稀薟黃脈病毒進(jìn)化關(guān)系相對(duì)其它begomoviruses較近。

根據(jù)雙生病毒科分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，即病毒全基因組核苷酸序列同源性小于89%，往往定名為不同病毒，大于89%，則認(rèn)為是同一病毒的不同株系［1］。以上分析結(jié)果表明:FJ12 DNA－A是稀薟黃脈病毒在福建的一個(gè)新的分離物。

3.2 衛(wèi)星DNAβ分子的分子特征

利用特異性引物beta01/beta02擴(kuò)增到約1300 bp的片段，經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)是DNAβ分子(FJ12β)。FJ12β全長(zhǎng)為1331 nts，具有典型的伴隨衛(wèi)星分子的基因組結(jié)構(gòu):含有一個(gè)保守的ORF，是編碼116個(gè)氨基酸的βCl基因;含有一個(gè)保守的SCR區(qū)，并在SCR的3’端具有九核苷酸TAATATT/AC;一個(gè)富含腺嘌呤A的區(qū)域(A－rich region)，序列的位置在717～979nts，其中A含量達(dá)到51.0～52.5%，A的重復(fù)數(shù)最高為7個(gè)。

序列比較分析結(jié)果顯示，F(xiàn)J12β與已知的衛(wèi)星分子的同源性都很低，只有30.6% ～70.2%。其中，F(xiàn)J12β與 SbYVV DNAβ相似性最高，為70.2%。βCl相似性也與SbYVV DNAβ最高，為92.2%，其余都在25.0% ～44.8%之間。SCR是 DNAβ 分子中最保守的區(qū)域，其相似性為74.8% ～97.0%，其中與SbYVV DNAβ最高，為97.0%。這說(shuō)明稀薟樣品中的DNAβ分子確實(shí)可以用保守的SCR區(qū)作為探針檢測(cè)到，但它是一類(lèi)全新的DNAβ分子，伴隨于稀薟樣品中發(fā)現(xiàn)的DNA－A(表2)。

表2 FJ12β與其他DNAβ的全長(zhǎng)核苷酸及βC1編碼的氨基酸序列相似性比較 %

為了進(jìn)一步明確這FJ12β與其它衛(wèi)星分子的系統(tǒng)親緣關(guān)系，構(gòu)建了基于DNAβ核苷酸序列的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(圖B)。從圖上可看出，與序列比較的結(jié)果相似，F(xiàn)J12在系統(tǒng)樹(shù)上與SbYVV聚類(lèi)在一起成一個(gè)小分支，與稀薟黃脈病毒進(jìn)化關(guān)系相對(duì)其它begomoviruses較近。

圖1 FJ12DNA－A和其他雙生病毒全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(A)FJ12β和其他雙生病毒DNAβ全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(B)

根據(jù)雙生病毒科衛(wèi)星分子分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，即病毒衛(wèi)星分子全基因組核苷酸序列同源性小于78%，往往定名為不同病毒，大于78%，則認(rèn)為是同一病毒衛(wèi)星的不同株系［18］。以上分析結(jié)果表明，F(xiàn)J12 DNAβ是雙生病毒伴隨衛(wèi)星的一個(gè)新種，建議命名為福建稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星分子。

4 結(jié)語(yǔ)

(1)FJ12稀薟樣品都由雙生病毒侵染，該病毒是單組份雙生病毒，基因組由一個(gè)DNA－A組分(FJ12DNA－A及其伴隨衛(wèi)星DNAβ分子(FJ12DNAβ)組成。不含有 DNA－B和 DNA－1組分;

(2)FJ12 DNA－A全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%。根據(jù)雙生病毒分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明FJ12稀薟樣品上的雙生病毒為稀薟黃脈病毒在福建的一個(gè)新的分離物。

(3)FJ12DNAβ分子全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星的同源性最高，為70.2%。根據(jù)雙生病毒伴隨衛(wèi)星的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明FJ12DNAβ是一個(gè)新型的衛(wèi)星分子，我們推薦將其命名為福建稀稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星分子。

(4)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，F(xiàn)J12 DNA－A和FJ12DNAβ都與稀薟黃脈病毒的親緣關(guān)系最近，推測(cè)DNA－A在進(jìn)化過(guò)程中捕獲了其他植物或病毒的分子后，重組得到新的DNAβ分子。

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