布地奈德對變應性鼻炎嗅覺障礙干預作用的實驗研究

王曉巍，朱瑩瑩，倪道鳳

嗅覺作為人體的重要感覺之一，在人類的社會生活中發揮著重要的作用。嗅覺的主要功能包括辨別氣味、識別環境、引起食欲及情緒調節等。人的嗅覺敏感與否對生活、學習和工作影響很大。嗅覺障礙在人群中并不少見，有研究曾對150萬人進行嗅覺調查，其中1.2%有永久性嗅覺喪失，62.4%有暫時性嗅覺喪失［1］。

多種因素可引起臨床嗅覺障礙。變應性鼻炎 (allergic rhinitis，AR)是常見的耳鼻咽喉科疾病，也是臨床上引起嗅覺障礙的主要原因之一。目前各項流行病學研究趨向認為，在人群中，AR的發病率為10% ～30%［2］。嗅覺障礙是AR的常見伴隨癥狀，有較多相關報道提到嗅覺喪失或減退與鼻部變態反應相關［3］。Cowart等［4］調查顯示23.1%的AR患者存在嗅覺減退。Rombaux等［5］報道AR引起嗅覺減退的發病率為15% ～20%。AR引起嗅覺障礙的機制尚未完全明了。既往的觀點認為由于鼻腔的炎癥導致氣味分子到達鼻腔頂部嗅覺感受器的通道受阻是導致嗅覺障礙的主要原因，即傳導性嗅覺障礙。而近來的研究表明，嗅上皮因變態反應引起嗅上皮組織病理學變化，即感覺性嗅覺障礙，可能是AR患者產生嗅覺障礙的直接原因之一［6］。

無論是AR，還是其他原因導致的嗅覺障礙，目前尚無理想的治療藥物。臨床上常應用糖皮質激素 (glucocorticoid，GC)來治療嗅覺障礙。Faulcon等［7］用GC治療41例病毒感染后嗅覺障礙的患者，發現治療后效果良好。Heilmann等［8］對55例患者的臨床研究發現，口服潑尼松龍可以改善上呼吸道感染、鼻竇炎、特發性嗅覺障礙等各種原因引起的嗅覺障礙。Stevens［9］指出對鼻息肉鼻內鏡術后已解除阻塞但仍有嗅覺障礙的患者，每天口服40 mg潑尼松 (逐漸減量)有助于嗅覺的改善。北京協和醫院耳鼻喉科在臨床應用局部氣動噴射霧化吸入GC治療嗅覺障礙也取得了較好的療效［10－11］。目前尚缺乏應用GC專門針對AR引發的嗅覺障礙進行治療的臨床研究，但GC作為AR的一線選擇用藥，已經在臨床工作中得到廣泛應用。本實驗研究是采用卵清蛋白致敏小鼠，建立AR的小鼠模型，觀察小鼠鼻腔嗅上皮的組織病理學變化。進而通過鼻內滴用布地奈德，對小鼠嗅黏膜的嗅覺標記蛋白 (olfactory marker protein，OMP)的表達水平進行定量分析，探討GC治療AR嗅覺障礙的作用。

1 資料與方法

1.1 造模

1.1.1 實驗動物 清潔級BALB/C小鼠70只，雄性，8周齡，體質量 (25±1)g。應用隨機數字表以簡單隨機化分組法將全部動物分為模型組 (60只)及對照組 (10只)。

1.1.2 致敏階段 模型組小鼠腹腔注射卵清蛋白Al(OH)3溶液，濃度40μg/ml。配制方法以20 mg卵清蛋白加2 mg Al(OH)3佐劑，0.9%氯化鈉溶液定容500 ml，溶液于臨用前配制。腹腔注射200μl(約300μg/kg)，隔天1次，連續7次。對照組以等量0.9%氯化鈉溶液代替卵清蛋白溶液。

1.1.3 激發階段 模型組小鼠鼻腔滴入卵清蛋白溶液，濃度為50μg/ml。于致敏階段結束間隔7 d后，以戊巴比妥腹腔內注射麻醉，以移液器吸取卵清蛋白溶液40μl(約80μg/kg)，緩慢均勻滴入小鼠雙側前鼻孔，隨呼吸進入鼻腔。每天激發1次，連續激發7 d。對照組以等量0.9%氯化鈉溶液代替卵清蛋白溶液。

1.1.4 造模評估 采用癥狀行為學疊加量化計分法對模型組進行評估［12］。于末次鼻腔激發致敏后立即觀察30 min，記錄小鼠鼻分泌量、噴嚏次數及搔鼻情況，采用疊加量化計分法，總積分＞5分者為造模成功 (見表1)。

表1 癥狀記分標準表Table 1 Symptom scoring standard

1.2 嗅覺功能評估 嗅覺障礙檢查采用埋藏小球實驗 (buried food test，BFT):將食物小球埋藏在墊料中，位置隨機選擇，深度為1～2 cm。將模型組小鼠放入實驗場所中，以300 s(5次測試的平均值)內未找到食物小球的小鼠即定為存在嗅覺功能障礙，列入AR伴嗅覺障礙組 (42只)，其余小鼠列入AR不伴嗅覺障礙組 (13只)。同時對對照組小鼠進行BFT測試，并與模型組結果進行對照。

1.3 組織取材 于建模成功后第3天，選取全部對照組小鼠及AR不伴嗅覺障礙組小鼠、AR伴嗅覺障礙組小鼠各9只。斷髓處死動物，去除頭部的毛皮，暴露頭顱標本。進一步修剪頭顱標本，保留鼻腔上部，包括鼻中隔、鼻腔外側壁及篩板。將標本浸于4%多聚甲醛溶液中約48 h，取出后浸入10%EDTA溶液中脫鈣14 d，每日更換脫鈣液。14 d后，標本以自來水沖洗24 h，之后重新浸入4%多聚甲醛溶液中固定約24 h。1.4 藥物干預 將剩余的AR伴嗅覺障礙組小鼠簡單隨機化分為不用藥組10只、布地奈德干預1組及布地奈德干預2組各11只。布地奈德干預1、2組小鼠雙側鼻腔內各滴入30μl布地奈德 (雷諾考特，鼻內噴霧用細微顆粒混懸液，規格為7.68 mg，6 ml，阿斯麗康公司)藥物原液，1次/d，連續5 d。不用藥組不給予藥物干預。于開始給藥后第7天處死布地奈德干預1組及不用藥組動物并取材，于開始給藥后第14天處死布地奈德干預2組動物，同法取材。

1.5 HE染色 在對照組、AR不伴嗅覺障礙組、AR伴嗅覺障礙組中，每組隨機選取3個標本，每個標本隨機選取切片做HE染色。

1.6 免疫組化 各組中每組簡單隨機化選取3個標本，每個標本隨機選取切片。光鏡下觀察，每個標本各5張切片，在統一放大倍數 (×400)下，隨機檢測并計數5個高倍視野 (×400)下的全部OMP陽性細胞。

1.7 統計學方法 采用SPSS 11.0統計分析軟件進行處理，所得到的數值以表示，各組數據的比較應用t檢驗，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 一般指標觀察 在鼻內滴液激發階段過后，模型組小鼠死亡5只，對照組小鼠死亡2只。存活的兩組小鼠均毛色光澤，攝食飲水正常，反應靈敏，活動正常、活躍。

2.2 造模評估 采用癥狀行為學疊加量化計分法對模型進行評估。經觀察對比，模型組小鼠在致敏前計分均值為 (0.51±0.49)，經致敏激發后模型組小鼠頻頻用前爪抓搔鼻端兩側，并伴有發作性的噴嚏動作，鼻分泌物流出量從鼻端兩道濕痕至鼻口周圍大量清亮液體不等 (見表2)。模型組小鼠在致敏激發后計分均值為 (6.17±1.67)分，計分明顯增高，且差異有統計學意義 (t=3.964，p＜0.01)。對照組小鼠給藥前計分均值 (0.47±0.38)分，給藥后未出現明顯癥狀，計分均值為 (0.63±0.47)分，計分增高無明顯變化，且差異無統計學意義 (t=1.593，P＞0.05)。因而可以認定本實驗采用卵清蛋白致敏激發小鼠建立AR小鼠模型的方法是成功的。

2.3 嗅覺功能評估 應用BFT，分別對模型組及對照組小鼠進行嗅覺功能評估。其中對照組8只小鼠均可于300 s內找到埋藏的食物小球，平均時間 (122±4)s。而模型組小鼠中有13只于300 s內找到食物小球，平均時間 (159±3)s。其余42只均無法在300 s內尋找到埋藏的食物小球。伴有嗅覺障礙的模型小鼠占全部模型組小鼠數量的76.36%。

2.4 HE染色 對照組:嗅區黏膜由上皮層和固有層構成(見圖1)。嗅上皮可見 ORNs、支持細胞 (supporting cells，SCs)和基底細胞 (basal cells，BCs)。嗅感受神經元 (olfactory receptor neurons，ORNs)的細胞核為類圓形，深藍色，位于嗅上皮的中部，呈多層排列，7～8層;SCs的細胞核為橢圓形，淡藍色，位于嗅上皮近表層;BCs的細胞核較小，扁圓形，位于嗅上皮的底層，靠近基底膜;固有層中可見嗅神經和血管 (見圖2)。嗅黏膜上皮層中各層細胞排列整齊，極性明顯 (見圖3A)。模型組嗅黏膜上皮層變薄，ORNs層數減少，排列紊亂，與對照組有明顯區別 (見圖3B、3C)。

2.5 免疫組化 對照組:光鏡下OMP免疫陽性細胞為棕褐色染色，分布于嗅黏膜的上皮層和固有層，在嗅黏膜表面的纖毛也可見OMP反應 (見圖4、5A)。模型組:鏡下見嗅黏膜上皮層變薄，染色變淡，OMP表達較對照組減少 (見圖5B、5C)。經圖像分析儀對5個高倍視野 (×400)下的上皮層染色陽性細胞進行計數，AR不伴嗅覺障礙組與對照組比較差異無統計學意義 (t=1.237，P＞0.05);AR伴嗅覺障礙組與對照組比較差異有統計學意義 (t=6.921，p＜0.05)。經過藥物干預階段，進一步對AR伴嗅覺障礙小鼠進行觀察，其中不用藥組:嗅黏膜上皮層厚度有所增加，細胞排列仍較紊亂。上皮層OMP表達稍有增多 (見圖5D)。OMP染色陽性細胞數與AR伴嗅覺障礙組比較差異無統計學意義 (t=2.003，P＞0.05)。布地奈德干預1組:嗅黏膜上皮層厚度有所增加，上皮層OMP表達增多 (見圖5E)。OMP染色陽性細胞數與AR伴嗅覺障礙組比較差異有統計學意義 (t=3.360，p＜0.05)，與對照組比較差異無統計學意義 (t=1.676，P＞0.05)。布地奈德干預2組:與布地奈德干預1組表現相似 (見圖5F)，OMP染色陽性細胞數與布地奈德干預1組比較差異無統計學意義(t=1.197，P ＞0.05，見表3)。

表2 模型組小鼠癥狀觀察情況 (只)Table 2 Symptom observation of rats in model group

表3 各組嗅上皮OMP染色陽性細胞數比較Table 3 Comparsion of olfactory epithelium OMPpositive cells in each group

圖1 小鼠嗅黏膜HE染色 (×100)示:小鼠嗅黏膜由上皮層和固有層構成。嗅黏膜上皮層 (?);嗅黏膜固有層 (☆)Figure 1 HE staining of rat olfactory mucosa:olfactory mucosa of rat is composed by epithelium and lamina propria.Epithelium propria(?)，lamina propria(☆)

圖2 小鼠嗅黏膜HE染色 (×200)示:嗅感受神經元 (O);支持細胞 (S);基底細胞 (B);血管 (?);固有層嗅神經纖維(☆)Figure 2 HE staining of rat olfactory mucosa:olfactory receptor neurons(O)，supporting cells(S)，basal cells(B)，blood vessel(?)，olfactory nerve fiber in lamina propria(☆)

圖3 各組小鼠嗅黏膜HE染色 (×400)Figure 3 HE staining of rat olfactory mucosa in each group

圖4 小鼠嗅黏膜免疫組化OMP表達 (×200):OMP免疫陽性細胞為棕黃色染色。嗅黏膜上皮層 (?);嗅黏膜固有層 (☆)Figure 4 Immunohistochemical expression of OMP in rat olfactory mucosa(×200):OMP immunoreactive cells are brownish yellow staining.Epithelium propria(?)，lamina propria(☆)

圖5 各組小鼠嗅黏膜免疫組化OMP表達 (×400)Figure 5 Immunohistochemical expression of OMP in rat olfactory mucosa in each group

3 討論

AR是特應性個體接觸致敏原后由IgE介導的遞質 (主要是組胺)釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病。AR的主要臨床表現有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏以及嗅覺功能障礙等。由于其在人群中發病率高，且發病率有逐年增加的趨勢［13－14］，特別是其可損傷患者嗅覺引發嗅覺障礙［15－16］。因此AR是引起嗅覺障礙的主要因素之一。

建立動物模型是研究AR發病機制及病理生理變化的基礎和手段。本實驗選擇BALB/C小鼠作為建模動物，利用卵清蛋白加佐劑氫氧化鋁先使動物機體致敏，再滴鼻維持致敏狀態，方法簡單，復制了在體征和病程方面都與人的臨床AR近似的動物疾病模型，經癥狀行為學測試符合建模成功的標準。以實驗動物行為學的改變評估其嗅覺功能是目前廣泛應用的實驗方法。BFT是Edwards早在1972年就在研究小鼠嗅覺障礙的行為時即已應用了的嗅覺評估方法。此后該類方法不斷改進［12－18］。進行BFT操作所需實驗裝置花費低，操作比較容易，具有良好的可行性及可重復性。判斷嗅覺障礙的標準即找到食物小球的時間大于300 s為存在嗅覺障礙。在本實驗分組前對所有小鼠進行BFT預評估，所有小鼠均在300 s內找到食物小球。嗅覺行為學試驗以300 s為分組標準是合理可行的。通過BFT檢測，約76.36%的AR小鼠表現出嗅覺功能的障礙，可見嗅覺障礙是AR常見的癥狀。本實驗中，AR模型動物的嗅黏膜上皮層變薄，各層細胞排列不整齊，層數明顯減少，極性消失，說明AR模型小鼠的嗅黏膜發生了明顯的病理改變，其嗅感受神經元本身存在病理損傷。

在嗅覺相關的研究中，OMP是近年來頗受關注的熱點。OMP是與嗅覺密切相關的一種蛋白質，特異性地表達于成熟的ORNs。ORNs是嗅黏膜內惟一的神經元，其功能是感受空氣中的氣味分子，將化學信號轉化為電信號，向嗅球和嗅覺高級中樞傳遞嗅覺信息［19－21］。研究嗅上皮中OMP的表達，可以顯示出ORNs在嗅上皮內的分布情況，并能說明致病因素對嗅上皮中ORNs的影響。本實驗通過免疫組化方法，對嗅上皮中的OMP表達進行定位、定性及定量的分析。結果顯示，AR小鼠嗅黏膜的OMP表達比對照組減低，其中伴有嗅覺障礙的AR小鼠嗅黏膜的OMP表達水平顯著低于對照組。進一步說明了AR伴有嗅覺障礙的小鼠嗅黏膜本身發生了病理改變。

GC是臨床治療嗅覺障礙的常用藥物［22］。GC治療嗅覺障礙的作用機制尚不完全清楚。目前已知GC通過抑制炎性細胞因子的產生，誘導抗炎因子的合成，減輕嗅黏膜的炎癥反應，減輕其充血和腫脹，以增加空氣中的氣味分子與嗅區黏膜的接觸面積，促進氣味分子與ORNs結合，改善嗅覺。除上述的改善傳導性因素的作用外，糖皮質激素對嗅黏膜本身也發揮著直接的作用。研究發現嗅黏膜中存在糖皮質激素受體［23］，存在接受糖皮質激素調節的Na+－K+－ATP酶［24］。這些分子水平上的發現，均為GC通過直接影響嗅黏膜治療嗅覺障礙提供了一定的理論依據。本實驗中，應用布地奈德鼻內滴用進行干預7 d后，觀察到小鼠嗅黏膜OMP的表達顯著高于用藥前水平，也高于同期觀察的不用藥的小鼠，而與對照組的OMP表達水平相當，說明鼻內局部應用糖皮質激素可以增加嗅上皮中嗅感受神經元的數量。而用藥后第14天觀察到的嗅黏膜OMP表達與用藥后7 d的結果相當，均與對照組OMP的表達無明顯差異，說明鼻內局部應用糖皮質激素增加嗅上皮ORNs的數量、改善嗅覺功能的作用，可以持續較長時間。在臨床工作中，對于全身應用糖皮質激素，其對機體產生的副作用是醫患雙方均力圖規避的問題。而鼻內局部應用的糖皮質激素藥物具有局部吸收，全身生物利用度低，副作用小的明顯優點。因此，鼻內局部應用糖皮質激素是治療AR引起的嗅覺障礙的較好方法。

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