凋亡相關蛋白FLIP和NF－κB在人骨肉瘤中表達及其與凋亡的關系研究

付文娟，趙濟華，甘洪全，翟宏芳，李琪佳

凋亡抑制蛋白FLIP是新近發現的與惡性腫瘤的發生及轉移侵襲密切相關的因子。其全稱是Fas相關死亡域樣白介素－1β轉換酶抑制蛋白 (fas－associated death domain like IL－1 beta converting enzyme inhibitory protein，FLIP)。當腫瘤細胞中FLIP蛋白過表達時，其凋亡過程受到抑制，腫瘤細胞在體內過度堆積，而導致惡性腫瘤的發生。因而FLIP與腫瘤細胞生長密切相關，其作用不可忽視［1］。NF－κB(nuclear factorkappa B)是一類廣泛存在于多種組織細胞中，具有多向轉錄調節作用的核蛋白因子。屬于Rel家族成員，能將高等真核細胞外信號傳導至核內從而引起基因特殊位點表達。NF－κB過度激活與許多病理現象有關。其中在細胞增殖與凋亡中具有核心作用。除能抑制腫瘤細胞凋亡外，還可具有促進細胞凋亡作用，因此是一種雙向調節因子［2］。

上述兩種因子在骨肉瘤組織中的表達及相互關系的相關研究報導尚不多見。本研究采用免疫組織化學方法來檢測FLIP、NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達，并采用TUNEL法檢測骨肉瘤中細胞凋亡程度，探討二者在骨肉瘤細胞增殖活性與凋亡中的相互關系，為骨肉瘤的基因治療奠定實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 標本采集 石蠟標本取自唐山市骨科醫院及唐山市人民醫院2002—2008年骨肉瘤手術石蠟標本55例 (實驗組)。其中男41例，女14例，年齡12～57歲，平均 (25.3±8.4)歲。同時收集同一醫院骨軟骨瘤石蠟標本30例 (對照組)。選擇腫瘤實質灰白色或灰紅色外觀區取材并進行常規病理染色，請專業病理醫生確診，后進行免疫組織化及細胞凋亡(TUNEL法)檢測。

1.2 試劑及檢測方法 免抗人FLIP多克隆抗體，工作濃度1∶100。免抗人NF－κB多克隆抗體，濃度1∶160。二抗兩步法免疫組織化學試劑盒 (即用型)、細胞凋亡 (TUNEL)檢測試劑盒。以上試劑均購自北京中杉生物技術公司。

石蠟切片4～5μm，實驗組及對照組FLIP及NF－κB蛋白的表達強度應用免疫組織化學兩步法檢測。應用TUNEL法通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測骨肉瘤組及骨軟骨瘤組細胞凋亡。上述實驗均設陽性對照及陰性對照以證明其準確性。

1.3 實驗結果的判定 FLIP陽性為腫瘤細胞質出現褐色顆粒，NF－κB陽性則細胞核出現褐色顆粒。結果統計以每例中每張切片觀察5個200倍視野 (×200)，對其中腫瘤細胞胞漿或胞核中陽性表達的褐色顆粒進行標記，計數所有檢測視野中的陽性顆粒。經醫學圖像分析系統對各組結果進行平均光密度 (optical density，OD)檢測及分析［3］。

TUNEL法檢測細胞凋亡:石蠟切片按TUNEL檢測試劑盒說明染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡并計算凋亡指數 (AI)，即凋亡率計算方法:每張切片隨機選取5個高倍 (×200倍)視野，計數凋亡細胞平均數，按公式計算凋亡率:細胞凋亡率=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0進行統計學分析。兩組間均數的比較采用t檢驗;將骨肉瘤組FLIP，NF－κB蛋白表達的強度 (OD值)與凋亡率進行相關性分析，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達 骨肉瘤組織中FLIP蛋白陽性位于骨肉瘤及骨軟骨瘤細胞質內棕褐色 (見圖1);而NF－κB蛋白則位于細胞核 (見圖2)。骨肉瘤組織中陽性細胞體積較大，核大，可見核分裂像，呈彌漫分布。骨肉瘤組中FLIP蛋白表達強度高于骨軟骨瘤，兩組間差異有統計學意義 (p＜0.05)。NF－κB蛋白在骨肉瘤組織中表達強度高于骨軟骨瘤組織，兩組間差異有統計學意義 (p＜0.05，見表1)。

2.2 TUNEL檢測骨肉瘤細胞凋亡 通過TUNEL方法經異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)標記，用激光共聚焦顯微鏡觀察，可見呈致密綠色熒光的凋亡細胞及凋亡小體 (見圖3);實驗組腫瘤細胞凋亡數 (17.586±0.817)%明顯低于對照組的 (32.524±1.601)% (t=32.372，p＜0.05)。

2.3 FLIP的表達與骨肉瘤細胞凋亡的關系 采用直線相關分析，FLIP表達與細胞凋亡指數呈負相關 (r=－0.949，p＜0.01)。NF－κB蛋白表達與細胞凋亡指數亦呈負相關 (r=－0.877，p＜0.01)。經相關分析得出，二者表達呈正相關(r=0.971，p＜0.01)。

表1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達 (x±s)Table 1 The expression of FLIP and NF－κB protein in osteosarcoma and osteochondroma groups

圖1 FLIP蛋白表達于骨肉瘤細胞質 (IHC，×200)Figure 1 Positive expression of FLIPprotein in the cytoplasm of osteosarcoma cells

圖2 NF－κB蛋白表達于骨肉瘤細胞核 (IHC，×200)Figure 2 Positive expression of NF－κB protein in the nucleus of osteosarcoma cells

圖3 凋亡細胞及凋亡小體呈致密綠色熒光 (圓圈處為綠色熒光處，TUNEL，×400)Figure 3 The green fluorescence was found in apoptotic cells and apoptotic bodies

3 討論

腫瘤發生發展過程中凋亡失衡機制起著重要作用。腫瘤細胞可通過不同機制逃逸受體介導的凋亡，使其得以繼續生長。腫瘤細胞凋亡受抑是其發生、發展的標志。因此凋亡抑制蛋白在腫瘤中過度表達已成為抗腫瘤治療的新靶點。設計藥物去誘導腫瘤細胞的凋亡既可阻滯腫瘤細胞復制又可殺傷腫瘤細胞［4］。

凋亡抑制蛋白FLIP因能抑制Fas介導的凋亡，從而使腫瘤細胞過度生長，在許多類型腫瘤細胞中均呈過度表達。此外，FLIP還能阻斷腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TRAIL)、死亡受體 (DR4)等其他細胞表面死亡受體介導的凋亡信號的轉導。因為它們的通路上具有FADD或Caspase－8的環節，FLIP的DED端可與之結合，阻止其后續環節，從而抑制凋亡［5－6］。

研究發現FLIP在惡性黑色素瘤、結腸癌、肺小細胞癌、子宮內膜癌、胃癌、前列腺癌等多種人類腫瘤中均呈過表達狀態;而對應的正常組織或良性病變中，FLIP不表達或呈低水平表達。在一些對化療藥物有抵抗作用的惡性腫瘤中已發現有FLIP蛋白過表達。目前已經研制出針對凋亡抑制蛋白的反義寡核苷酸和小分子抑制劑，現正處于早期臨床試用階段［7－8］。本研究免疫組化結果顯示:55例骨肉瘤中，FLIP蛋白表達的OD值明顯高于骨軟骨瘤，這與以往的文獻報道一致。說明骨肉瘤的發生與FLIP蛋白高表達有直接關系，其機制可能是FLIP表達后與Caspase－8競爭在DED上的結合位點，從而阻斷死亡受體 Fas、TNF－R1及 TRAIL介導的凋亡，使與Caspase－8相關的凋亡途徑受到抑制，甚至中斷。因此FLIP可能通過抑制癌細胞凋亡參與骨肉瘤的發生發展，FLIP具有抗凋亡作用并能在骨肉瘤的惡性進展中起重要作用［9］。

同時本實驗采用TUNEL技術，對55例骨肉瘤及30例骨軟骨瘤進行了細胞凋亡檢測以探討腫瘤細胞凋亡與FLIP的關系。結果顯示:骨肉瘤組凋亡指數明顯低于骨軟骨瘤組。說明雖然骨肉瘤及骨軟骨瘤均有細胞凋亡異常，但前者為分化差的惡性腫瘤，而后者為良性腫瘤，分化程度越低其凋亡的程度也越低。說明細胞凋亡通路受癌基因過度表達而受到抑制，相反，細胞凋亡與細胞增殖則成反比。一旦凋亡、增殖平衡被打破，機體不能及時清除惡變的腫瘤細胞，則以腫瘤細胞的增殖為主，惡性腫瘤發展迅速［10］。同時本實驗又檢測了骨肉瘤中FLIP蛋白表達與其細胞凋亡的關系，結果發現:FLIP蛋白表達與骨肉瘤細胞凋亡指數之間存在負相關。

NF－κB是廣泛存在于各種細胞中的具有多向轉錄調節功能的核蛋白因子，參與機體的免疫炎癥反應、細胞周期調控、腫瘤發生及細胞凋亡等。能與多種細胞基因的啟動子和增強子中的κB序列位點特異性結合，上調轉錄活性，其可以調控一些細胞凋亡相關基因如FLIP基因、p53基因的轉錄表達，從而明顯提高腫瘤細胞的抗凋亡能力。因c－FLIP基因編碼序列中存在κB位點，故腫瘤細胞中高表達的NF－κB蛋白能上調FLIP的轉錄表達，使腫瘤細胞逃避Fas、TRAIL介導的凋亡信號的調控。此外NF－κB不僅參與細胞惡性轉化，還能通過腫瘤細胞增殖與凋亡的平衡失調參與惡性腫瘤的浸潤與轉移［11］。無論是良性增生性病變還是惡性腫瘤的發生，所導致的NF－kB活化，其主要作用都是抑制細胞凋亡，故在一般情況下，NF－kB均被認為是凋亡抑制因子，在惡性腫瘤中均呈明顯高表達。

本研究結果顯示:骨肉瘤組織中NF－κB蛋白陽性明顯高于骨軟骨瘤。表明骨肉瘤增殖速度高于骨軟骨瘤且說明NF－κB的表達強度影響腫瘤的良惡性程度。關于NF－κB致癌機制，目前傾向于通過上調抗凋亡基因或誘導TRAF(TNF受體相關因子)和IAP(凋亡抑制蛋白)而拮抗凋亡，亦可通過調節腫瘤細胞增殖或通過上調細胞周期蛋白表達而促進腫瘤的發生、發展［12－13］。本研究也發現骨肉瘤中存在NF－κB表達增強，且細胞核內有強陽性信號出現，說明NF－κB在核內存在活化，提示NF－κB在骨肉瘤的發生發展中發揮著重要的作用。

關于FLIP與NF－κB蛋白在骨肉瘤組織中的表達及相互關系的相關研究報導尚少見。相關研究認為，NF－κB的異常表達與活化可以誘導FLIP的表達，而FLIP在NF－κB發揮抗凋亡過程中起著重要作用。Okano等［14］在進行肝細胞癌的相關研究時發現，c－FLIP的過度表達可激活NF－κB，而c－FLIP表達下調時能減弱TNF－α等誘導的NF－κB的活化。本實驗發現，骨肉瘤組織FLIP與NF－κB表達之間存在著一定的正相關關系，表明兩者在骨肉瘤發生發展中存在促進作用，共同參與骨肉瘤的形成。

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