酶法降解茶葉多糖技術研究

安徽農業大學生命科學學院 黃世霞 王在貴＊ 劉學詩

茶葉多糖（tea polysaccharides，TPS）是從茶葉中提取出來的多糖類復合物，具有降血糖、降血脂、抗氧化、增強免疫力等多種生物學功能 （招鈺等，2007；李布青等，1996）。其相對分子質量為40000～100000，易溶于熱水，不溶于高濃度的有機溶劑（徐仲溪和王坤波，2004）。茶多糖的溶解性是其性質的一項很重要的指標，一般多糖分子質量越大，溶解性越低，不利于多糖穿越多重細胞內膜系統，從而影響其生物活性（Chen等，2009）。而低分子質量的多糖易于腸壁細胞結合，具有抑制有害菌，阻止腸道毒素的吸收等生理功能。目前關于低分子質量的茶葉多糖的制備及其生理活性的研究仍鮮有報道。本研究利用酶法降解茶多糖降低其聚合度，并研究了最適酶解參數，以期為茶葉低聚糖的制備及其生理活性的研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 茶葉多糖（由本實驗室提供），纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶（由某生物股份有限公司提供，于-30℃冰箱中保存）。檸檬酸、磷酸氫二鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、羧甲纖維鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 分別吸取0.1 mg/mL 葡 萄 糖 溶 液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL依次加入試管中，分別補加入蒸餾水至1.5 mL。每管中加3 mL DNS于沸水中煮10 min，自來水冷浴冷卻，加入10 mL蒸餾水稀釋混勻，于550 nm處進行比色測定，用空白管調零點，測定OD550，以葡萄糖濃度為橫坐標，以OD550為縱坐標繪制出標準曲線。每組2個平行。（注：每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線）。

1.2.2 茶葉多糖最適降解酶的篩選 取5 mg/mL茶葉多糖1 mL，分別加入0.5 mL木聚糖酶，0.5 mL纖維素酶，0.5 mL β-葡聚糖酶和0.5 mL混合酶液（1 mL β-葡聚糖酶與3 mL纖維素酶混合），40℃水浴10 min，然后分別加入3 mL水楊酸，迅速放到沸水中水浴10 min，冷卻，再分別加10 mL去離子水搖勻，測定OD550。

1.2.3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適溫度設定恒溫水浴鍋溫度分別為 30、35、40、45、50、55、60、65℃和70℃；茶葉多糖濃度為5 mg/mL，pH 7.0，反應時間為 10 min，測定 OD550。

1.2.4 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的熱穩定性測定 將β-葡聚糖酶分別放到60、70℃水浴鍋中保存 10、20、30、60、120、180、240 min， 每個時間終點取出1.5 mL酶液，按照上述方法測定OD550。

1.2.5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖最適pH 用pH 分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液配置濃度為5 mg/mL的茶葉多糖溶液，酶解溫度為37℃，反應時間為10 min，測定OD550。

1.2.6 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖pH穩定性測定用 pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液適當稀釋β-葡聚糖酶，37℃下水浴16 h后，測定各處理樣品降解茶葉多糖的OD550。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 葡萄糖標準曲線方程為 y=0.6071x-0.0057，R2=0.9954。

2.2 茶葉多糖最適降解酶篩選結果 用木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶以及纖維素酶與β-葡聚糖酶的混合酶液分別降解茶葉多糖，結果見圖1。由圖1可見，β-葡聚糖酶能很好的降解茶葉多糖，纖維素酶次之，復合酶液效果較差，木聚糖酶最差。

圖1 不同酶液對茶葉多糖的降解效果的影響

2.3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適溫度 用pH 7.0緩沖液配制的茶葉多糖溶液，在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃） 條件下測定β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的活力，結果見圖2。由圖2可知，β-葡聚糖酶降解茶葉多糖反應最適溫度為40℃，合適反應溫度為35～45℃。

2.4 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖熱穩定性的測定結果 在不同溫度條件下，于不同的時間點取出部分酶液測定酶解茶葉多糖能力，以未經過處理的酶液為對照，計算剩余活力，結果見圖3。由圖3可見，經過降解的茶葉多糖在60、70℃條件下，隨時間的延長酶活均會逐漸下降，70℃條件下保溫120 min已無酶活，60℃條件下保溫180 min酶活消失。

圖2 不同溫度對β-葡聚糖酶酶解茶葉多糖效果的影響

圖3 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的熱穩定性

2.5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適pH 在不同pH條件下測定β-葡聚糖酶降解茶葉多糖后的OD550值，結果見圖4。由圖4可知，β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的最適pH為7.0，合適pH范圍為6.0～8.0。

圖4 不同pH對β-葡聚糖酶酶解茶葉多糖效果的影響

2.6 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的pH穩定性測定結果 由圖5可知，在pH為4.0～7.0酶活穩定上升，而當pH高于7.0時酶活開始下降。pH為6.0～7.0酶活較穩定。

3 討論

圖5 β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的pH穩定性

木聚糖酶是降解木聚糖的β-1，4糖苷鍵的水解酶。纖維素酶為多種水解酶組成的復合酶系，可分解葡聚糖的β-1，4糖苷鍵；β-葡聚糖酶可催化水解葡聚糖的β-1，4糖苷鍵和β-1，3糖苷鍵。本研究結果表明，纖維素酶和β-葡聚糖酶相對木聚糖酶具有較強分解茶葉多糖的能力，其中β-葡聚糖酶酶解效果最佳。由此可見，茶葉多糖的一級結構存在一定β-1，3-糖苷鍵連接。

本研究對β-葡聚糖酶降解茶葉多糖的主要特性進行了進一步的研究。吳琪等（2011）研究表明，β-葡聚糖酶的最適反應溫為40～50℃，最適反應pH為7.5。郭雨桐和肖文軍（2011）研究發現，β-葡聚糖酶降解茯苓多糖的最適反應溫度為55℃，最適pH為5.5。本試驗結果表明，β-葡聚糖酶對茶葉多糖降解的最適溫度為40℃，最適pH為7.0。戴易興等（2011）利用乳糖誘導基因工程菌產的β-葡聚糖酶熱穩定性較好，在70℃左右下活力較高。關于降解茶葉多糖的最適酶及酶解體系仍需做進一步研究。

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