低氧誘導VEGF基因表達載體治療家兔肢體缺血性疾病的實驗研究

殷愛紅 武文琦 崔世軍 滕 旭 鄭少鵬*

(1.首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京 100069;2.首都醫科大學宣武醫院胸心血管外科，北京 100053;3.首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，北京 100069)

下肢缺血性疾病(ischemic lower limb)常見于下肢動脈硬化閉塞癥、糖尿病動脈硬化閉塞癥、下肢血栓閉塞性脈管炎等疾病，是一種嚴重危害人體健康、降低患者生活質量的疾病，具有較高的病死率。傳統的治療手段包括藥物治療、人工血管、自體血管搭橋和介入治療;對于嚴重的慢性肢體缺血患者，上述治療方法均有局限性［1-2］。Isner J M 等［3］首先采用血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因治療肢體缺血性疾病并獲得成功［3］，為缺血性疾病的治療提出了新方法。

缺血性疾病的治療性血管生成是心血管及肢體缺血性疾病的研究熱點，其中應用基因治療的方法，促進血管新生，建立側支循環，從而改善病變部位缺血狀況以達到治療的目的［4］。本研究采用含低氧反應元件的真核表達載體，誘導VEGF的表達對肢體缺血性疾病進行基因治療，探索適合缺血性疾病基因治療的載體。

1 材料和方法

1.1 材料

質粒pcDNA3.1由美國喬治敦大學Pedro A.Jose惠贈;缺氧誘導真核表達載體6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165由本室構建，其含有人VEGF的低氧反應元件(hypoxia responsive element，HRE)，經體外細胞實驗［5］證實此載體在低氧條件下可使VEGF的表達增強。質粒大量提取試劑盒(Plasmid Mega Kit)為德國Qiagen公司的產品。實驗動物為新西蘭白家兔40只，雌雄不限，平均體質量3 kg。動物許可證號:(2000)第017號。

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA的制備

將質粒pcDNA3.1和缺氧誘導真核表達載體6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165分別轉化后挑單個菌落接種至5 mL LB培養基中，培養至菌液OD600≈0.6，再將細菌接種到2 000 mL LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。4℃離心收集細菌。按QIAGEN Plasmid Mega Kit的說明書提取質粒DNA;質粒DNA經酶切鑒定正確后用0.9%氯化鈉注射液溶解，調整濃度為1 μg/μL，應用于動物基因治療的實驗研究。

1.2.2 家兔后肢缺血模型的制作

用1%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/Kg靜脈麻醉實驗動物，仰臥固定家兔后脫毛并進行消毒;縱行切開左側大腿正中的皮膚，暴露髂外動脈遠端和股動脈，自腹股溝韌帶至膝部內側行左下肢髂外動脈遠端和股動脈分支切斷剔除術［6］，制作家兔左后肢缺血模型。手術中給予抗生素(頭孢拉啶40 mg/Kg)靜脈點滴。

1.2.3 基因轉移

40只新西蘭兔進行血管切斷剔除術后立即注射質粒DNA或0.9%氯化鈉注射液。將動物采用抽簽法隨機分成3組，分別給予低氧誘導表達載體質粒6HRE-pcDNA3.1-h VEGF165(VEGF質粒組10只)、pcDNA3.1空載體(空載體組8只)或0.9%氯化鈉注射液(0.9%氯化鈉注射液組22只)，具體方法為400 μg/kg多點注射于股動脈供血區的大腿肌肉群;VEGF質粒組和空載體組分別注射相應的質粒DNA，0.9%氯化鈉注射液組只注射同體積不含質粒的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 臨床檢測

每只動物于術后進行臨床檢測，包括觀察患肢狀況(肢體活動狀況、肢體有無潰瘍、足趾壞疽、脫落等)、小腿脛動脈血壓測量、動脈血管造影、血液生化檢測等。

后肢脛動脈血壓的測量:使用便攜式多普勒超聲探測儀測量雙側后肢脛動脈血壓，術后3月內每周進行測量。

動脈血管造影:在術后1天、1周、2周、4周、6周和13周進行動脈血管造影。造影前將模型家兔予以常規麻醉、脫毛消毒和固定，手術暴露頸動脈后施行頸動脈插管，經動脈插管快速加壓注射造影劑歐乃派克(Omnipaque，奈科明愛爾蘭有限公司生產)10 mL，同時用血管造影機(GE公司OEC9800)進行連續拍照，記錄血管造影結果。

安全性觀察:在手術前(0 d)、術后2周、6周和13周抽取兔靜脈血進行丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的檢測，觀察肝、腎功能的改變。

1.3 統計學方法

使用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差()表示，組間比較采用兩因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 肢體缺血模型家兔的肢體狀況

所有動物在術后即出現左下肢的跛行，皮膚蒼白，皮膚溫度低。術后0.9%氯化鈉注射液組出現5例感染和6例不同程度的組織壞死;空載體組出現2例感染，1例肢端缺血性壞死;VEGF質粒組未出現傷口感染和肢端缺血性壞死，與對照組(0.9%氯化鈉注射液組和空載體組合稱對照組)比較，術后肢體狀況恢復快。

2.2 后肢小腿脛動脈血壓率

所有動物模型，無論VEGF質粒組或對照組，術后用多普勒超聲探測儀均測量不到手術側后肢脛動脈血壓，術后1周內2組動物的患側與健側脛動脈血壓率(L/R)均為0，提示2組動物均出現血管閉塞。VEGF質粒組在術后2周可檢測到患肢脛動脈血壓，血壓率隨后逐漸增加，而對照組仍測量不到手術側脛動脈血壓。術后4周，VEGF質粒組和對照組均可檢測到患肢脛動脈血壓，但VEGF質粒組的脛動脈血壓率明顯高于對照組(0.66±0.12 vs 0.29±0.13，P＜0.01)。術后6周，VEGF質粒組的脛動脈血壓率仍明顯高于對照組(0.64±0.15 vs 0.43±0.17，P＜0.05);術后8周，VEGF質粒組的脛動脈血壓率明顯高于對照組(0.83±0.06 vs 0.64±0.19，P＜0.05);術后約10周，VEGF質粒組的患肢脛動脈血壓恢復到正常。對照組于術后21d才可探測到患肢脛動脈的搏動，術后13周脛動脈壓恢復正常(表1)。

表1 術后家兔后肢脛動脈血壓率Tab.1 Lower limb blood pressure ratio in rabbit ischemic hind limb model after surgery()___________

表1 術后家兔后肢脛動脈血壓率Tab.1 Lower limb blood pressure ratio in rabbit ischemic hind limb model after surgery()___________

＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05 vs control;VEGF:vascular endothelial growth factor.

Group Number of case_________________________Lower limb blood pressure ratio(left/right)after operation_________________________1th week 2th week 4th week 6th week 8th week 10th week 12th week 13th week Vegf group 10 0 0.25 ±0.06＊＊ 0.66 ±0.12＊＊ 0.64 ±0.15*0.83 ±0.06*1.03 ±0.12 1.05 ±0.15 0.99 ±0.02 Control 30 0 0 0.29 ±0.13 0.43 ±0.17___0.64 ±0_.19_____0.89 ±0.20___0.96 ±0.23___1.0_______0±0.06

2.3 動脈血管造影

家兔肢體缺血模型術后1d進行動脈血管造影，以其健側肢體作為對照進行比較，VEGF質粒組與對照組均顯示左側股動脈結扎點遠端的動脈缺如形成

盲端，血管充盈顯著減慢，側支循環消失。術后1周，質粒組可見在血管斷端附近形成少量微細血管并出現小血管的充盈，血管充盈速度緩慢。術后2周，血管充盈速度仍然緩慢，但明顯可見新生血管建立的側支循環，遠端動脈也開始充盈;對照組新生血管數明顯少于VEGF質粒組，遠端動脈充盈不良，造影結果詳見圖1。術后4周，血管造影圖像顯示VEGF質粒組髂內動脈代償性增粗，股動脈手術缺如區域的血管網重建，動脈充盈速度明顯增加，出現許多小血管組成的側支循環，血管數明顯多于對照組;對照組動脈充盈速度仍然明顯慢于健側動脈，小血管組成的側支循環少，血管充盈不夠充分(圖1)。

圖1 家兔肢體缺血動物模型14d和28d血管造影結果Fig.1 Angiograms of rabbit ischemic hind limb model on 14 days and 28 days after surgery

2.4 血液生化檢測

家兔肢體缺血動物模型的血液生化檢測結果與國內外研究［7-8］所測定的正常結果比較，給予含VEGF的質粒DNA后，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的檢測結果均在正常范圍內(表2)。正常值范圍分別為:ALT(IU/L)25.56～79.66，AST(IU/L)31.09～88.93，CR(mg/L)1.4～16.6，BUN(mg/L)81～250。

表2 術后家兔血液生化檢測Tab.2 Biochemical values in rabbit blood after surgery(n=18)

3 討論

慢性肢體缺血性疾病可引起患者肢體疼痛、皮膚潰瘍、間歇性跛行等癥狀，甚至因肢體缺血性壞死而截肢，導致肢體殘疾，嚴重影響患者的生活質量，目前尚缺乏有效的臨床治療措施［1］。自20世紀以來，國內外許多研究者［3，8］采用治療性血管生成的基因治療方法，獲得了一定的療效。

基因治療中需要解決的關鍵問題包括治療性基因的選擇、基因載體、基因轉移的途徑等?；蜉d體是關系到基因治療成敗的較為關鍵的因素，其分為病毒載體和非病毒載體［10］。由于病毒載體可能引起機體嚴重的免疫反應，病毒DNA非特異性整合至宿主基因組可能導致宿主基因功能失調，甚至可能引起惡性腫瘤的發生［11］，因此，非病毒載體更為引人關注。非病毒載體中，使用裸DNA的方法具有DNA制備簡單、毒性低、免疫反應輕微、基因可以有效表達等優點，是臨床基因治療研究中采用較多的最為簡單的方法［4］。

基因治療中有關載體的另一關鍵問題是缺乏可調控性基因表達載體。治療性基因的精確調控仍是目前基因治療中具有挑戰的問題;研究較多的調控系統是天然或人工合成的增強子－啟動子系統，可被某些因素誘導，如熱沖擊、低氧、電離輻射、某些化學試劑等。常用于缺血性疾病基因治療的調控系統是低氧調控系統，常含有低氧反應元件(HRE)，當組織缺血或低氧時可使轉錄因子低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)表達增加，其作用于表達載體的HRE，誘導基因表達。使用可調控的基因表達系統除可調控基因表達外，還可顯著地降低潛在的安全隱患，尤其是對慢性疾病的基因治療［12］。在缺血性疾病的基因治療中，VEGF是有效的血管生成因子之一，如果使用可調控性表達載體，調控VEGF基因的表達，可避免在正常組織中由于VEGF大量表達所引起的不良反應，如內皮細胞來源的血管腫瘤、組織水腫等［13］。

本實驗采用自行構建的含VEGF基因和低氧反應元件(HRE)的低氧誘導真核表達載體，使用裸DNA直接肌肉注射的基因轉移方法進行了家兔肢體缺血模型的基因治療，初步觀察了此載體在家兔肢體缺血模型的治療作用;實驗結果說明此載體對家兔肢體缺血模型具有促進血管生成的作用，術后脛動脈壓恢復也早于對照組，血管造影結果顯示VEGF質粒組血管代償性增粗，手術缺如區域的血管網重建，患肢的新生血管生成和側支循環形成的時間均早于對照組，故具有一定的治療作用;基因治療期間家兔模型未出現明顯的肝腎功能損害。雖然肌肉內直接注射裸DNA后轉染和表達效率低，但肌肉組織可攝取質粒DNA，在注射局部基因可有效表達，此方法具有毒性低、組織損傷小、簡便等優點，并且基因可在肌肉組織持續表達數月也已被大量動物實驗和臨床實驗［4，14-15］所證實，因此本實驗采用裸DNA直接肌肉注射的方法是肢體缺血性疾病基因治療的常用方法。

治療性基因表達的嚴格調控可使治療性基因的表達控制在特定的細胞、組織或器官內，可有效地降低不良反應的發生，是基因治療中亟須解決的問題。開發可調控的基因表達系統和組織特異性的基因表達調控系統，可顯著降低基因治療中的危險因素，無論在缺血性疾病、神經退行性變等慢性疾病，或是腫瘤的基因治療中都是至關重要的，隨著相關理論與技術的發展，將會研究出更安全有效的基因治療載體，使缺血性疾病的基因治療能產生更好的效果。

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