膽堿能抗炎通路對內毒素復合油酸致大鼠急性肺損傷的影響

鄭 暉 許紹發 賈鴻彥 古淑香

1.首都醫科大學附屬北京胸科醫院麻醉科，北京 101149;2.首都醫科大學附屬北京胸科醫院胸外科，北京 101149;3.首都醫科大學附屬北京胸科醫院結核病分子生物學實驗室，北京 101149)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)由于發病機制尚不完全明確，同時缺乏有效的治療手段，發病率和病死率仍居高不下。研究［1］顯示其發病基礎與Toll－樣受體(Toll-like receptors，TLRs)介導的炎性反應有關。膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)是新近學者發現的一條神經－免疫調節通路［2］，它通過迷走神經及其遞質乙酰膽堿與免疫系統相互作用，參與抗炎作用。動物實驗研究結果［3］已經證實，CAP可以抑制脂多糖誘導的腫瘤壞死因子的產生和釋放，但其確切的作用靶點是否與TLRs有關目前未見報道。本研究擬采用電刺激迷走神經和靜脈注射膽堿酯酶抑制劑他克林的方法激活CAP，觀察其對內毒素復合油酸2次打擊致大鼠急性肺損傷的影響，并驗證其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

PCR擴增儀 (美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)，全自動血氣分析儀(瑞士AVL公司)，450 nm酶標儀(美國Bio-Rad公司)，動物呼吸機(HX-200，成都泰盟科技有限公司)，脂多糖(美國SIGMA公司)，油酸(分析純)(北京金龍科技有限公司)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(美國 MARKET公司)，羊抗 NF-κBp65單抗(武漢博士德生物工程公司)，大鼠IgG免疫印跡增強化學發光法試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，髓過氧化物酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(北京賽百盛生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理

24只清潔級雄性Wistar大鼠(北京市結核病胸部腫瘤研究所動物實驗室提供，SCXK:京2005－0004)，體質量250±20g。實驗前于本所動物實驗室飼養2周，常規飼料及飲水，晝夜交替12 h，飼養環境為清潔級。制模型前禁食不禁水12 h。2%戊巴比妥40 mg·kg－1腹腔注射麻醉后，沿正中線切開頸部皮膚，切開氣管，置入14G套管，與小動物呼吸機連接行機械通氣，潮氣量:3～5 mL，呼吸頻率:40～50次/min，吸入氧濃度:21%。分離右側股靜脈，置入22G套管針以作注射藥物之用，穩定10 min后開始分組操作并監測。按數字表法將動物隨機分4組，每組6只。①對照組(control group，C組):腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10 mL·kg－1;②急性肺損傷組(ALI組):腹腔注射1%內毒素(lipopolysaccharide，LPS)10 mg·kg－1，30 min后經股靜脈緩慢注射油酸(oleic acid，OA)0.15 mL·kg－1;③電刺激組(stimulation group，ST組):右頸迷走神經干連接刺激電極，以5 V、2 ms、1 Hz 強度持續刺激神經 10 min，腹腔注射1%LPS 10 mg·kg－1，再持續刺激神經10 min，20 min后經股靜脈緩慢注射OA 0.15 mL·kg－1;④他克林(tetrahydroaminoacridine，THA)組:靜脈注射THA 1.5 mg·kg－1，10 min 后行 ALI組操作。130 min 時活殺大鼠后取左肺組織，無菌冰0.9%氯化鈉注射液中洗凈肺內血液，立即分裝保存于液氮中。從頸總動脈采血2 mL置于無菌無致熱原Eppendorf管中，離心(4 000 r/min，4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。

1.2.2 血中pH和氣壓的檢測

實驗結束時抽取動脈血檢測pH值、血氧分壓(partial pressure of oxygen，PaO2)和二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)。

1.2.3 病理學檢查

處死大鼠，剖胸肉眼觀察肺臟形態學改變，取右肺下葉組織，經固定、包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察，根據肺間質水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成、肺不張改變，按程度“無、輕、中、重”分別計“0、1、2、3 分”，然后累計總分［4］。

1.2.4 肺組織含水量測定

取右肺上葉組織用冷0.9%氯化鈉注射液沖去殘血，濾紙吸干水分在分析天平上精確稱量濕質量(wet weight，W)，于80℃烘干 72h，再稱量干質量(dry weight，D)，以濕質量/干質量比值(W/D)表示肺組織含水量。

1.2.5 肺組織髓過氧化物酶(mycloperoxidase，MPO)測定

取部分左肺組織制備10%組織勻漿，不離心，用蛋白定量(雙縮脲法)測試盒測定組織勻漿蛋白濃度，用比色法測定肺組織MPO含量，以每克組織濕片中MPO活力單位表示。

1.2.6 左肺核轉錄因子－κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65含量檢測

采用免疫印跡方法檢測左肺組織中NF-κBp65含量。具體步驟:肺組織30 mg，加入裂解液中勻漿，離心(12 000 r/min，4℃)30 min，取上清，Bradford 法測定總蛋白濃度。樣本各取40 μg上樣，行10%SDSPAGE電泳分離蛋白，轉移至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，羊抗NF-κBp65單抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG 37℃孵育1 h，ECL顯像成影。掃描后用HPIAS-1000凝膠分析系統定量，計算光密度值(A)。

1.2.7 血清白細胞介素－6(interleukin-6，IL-6)含量測定

處死大鼠時從頸總動脈采血2 mL置于無菌無致熱源Eppendorf管中，離心(4 000 r/min 4℃)15 min后，取上清保存于－70℃。采用固相三明治夾心、酶聯免疫吸附試驗檢測血漿IL-6含量。

1.2.8 左肺組織TLR2和TLR4mRNA表達

采用逆轉錄－聚合酶鏈反應方法。具體步驟:取肺組織約100 mg抽提與純化總RNA。實驗所用引物應用呂鏜烽等［5］設計的引物，委托賽百盛公司合成。tlr2引物序列:上游引物:5'-AGT GAG TGG TGC AAG TAT GA-3';下游引物:5'-TAA GGC AAG ACA GAA ACA GG-3'。tlr4引物序列:上游引物:5'-CTG CAA TCA AGA GTG CTG AG-3';下游引物:5'-TTC TTG GCT TGA CCA GTC TC-3'。β-actin引物序列:上游引物:5'-ACT GCC GCA TCC TCT TCC TC-3';下游引物:5'-AAG CAT TTG CGG TGC ACG A-3'。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后應用凝膠成像儀拍照，凝膠分析軟件對電泳條帶進行分析，根據Marker確認目標基因擴增片段的條帶，以目的基因與內參對照的積分吸光度比值(tlr/β-actin ratio)表示 mRNA相對表達量。

1.3 統計學分析

用SPSS13.0統計軟件分析數據。計量數據以均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，均數多重比較采用Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血氣指標及病理學改變

ALI組與C組比較，pH，PaO2和PaCO2差異有統計學意義(P＜0.01);ST組和THA組與ALI組比較，pH，PaO2和PaCO2差異有統計學意義(P＜0.01)，詳見表1。肉眼觀察，C組左肺呈鮮紅色;ALI組呈暗紫色，彈性差，支氣管內可見粉紅色液體;ST組和THA組顏色稍暗。光鏡下ALI組肺泡破壞嚴重，大量組織液滲出;ST組和THA組大鼠肺組織充血，肺泡擴張(圖1)。病理學評分詳見表1。

2.2 肺W/D及MPO改變

ALI組與C組比較肺組織W/D及MPO活性差異有統計學意義(P＜0.01);ST組和THA組與ALI組比較2種測量值差異有統計學意義(表2)。

表1 4組動物動脈血氣及病理學評分結果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

表1 4組動物動脈血氣及病理學評分結果Tab.1 Comparison of blood gas parameters and pathological score among the 4 groups of animal(n=6，)

△1 mmHg=0.133 kPa;*P＜0.05 vs C group;＊＊P＜0.01 vs C group;▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;PaO2:partial pressure of oxygen;PaCO2:partial pressure of carbon dioxide.

圖1 4組大鼠肺組織病理改變Fig.1 Pathological changes of lung tissue of the 4 groups of rats(HE，100×)

表2 肺組織W/D值和MPO活性比較Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

表2 肺組織W/D值和MPO活性比較Tab.2 Comparison of lung tissue W/D value and MPO activities(n=6，)

＊＊P＜0.01 vs C group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs ALI group;C:control;ALI:acute lung injury;ST:stimulation;THA:tetrahydroaminoacridine;W/D:wet weight/dry weight;MPO:mycloperoxidase.

Group W/D MPO activity/(U·g－1)C group 4.52±0.64 0.36±0.08 ALI group 8.44±0.67＊＊ 1.20±0.14＊＊ST group 5.68±0.82▲ 0.42±0.06▲▲__THA group 5.02±0.66▲ 0.55±0.08▲▲______

2.3 肺組織 TLR2、TLR4 mRNA 表達、NF-κB p65及血清IL-6濃度改變

4組大鼠肺組織tlr2、tlr4和β-actin基因表達產物通過RT-PCR方法所得的特異性DNA片段長度分別為256 bp、355 bp和440 bp，與預期長度相符(圖2A)。與C組比較，其余3個實驗組肺組織TLR2和TLR4mRNA表達差異有統計學意義(P＜0.01);其他組組間比較差異無統計學意義(P﹥0.05)(圖2B，2C)。ALI組與C組比較肺組織NF-κB p65蛋白表達明顯增強，IL-6濃度顯著升高差異有統計學意義(P＜0.01);ST組、THA組與ALI組比較，NF-κB p65表達均減弱;血清IL-6濃度差異有統計學意義，詳見圖3，圖4。

3 討論

圖2 4組大鼠肺組織TLR2、TLR4 mRNA表達結果Fig.2 Results of TLR2，TLR4 mRNA RT-PCR of the 4 groups of rats(n=6，)

圖3 4組大鼠肺組織NF-κB p65蛋白水平Fig.3 Comparison of expression of NF-κB p65 protein in lung tissues of the 4 groups(n=6，)

圖4 4組大鼠血清IL-6濃度Fig.4 Serum level of IL-6 in rats of the 4 groups(n=6，)

大多數肺損傷病人是在受到一次打擊 (如燒傷、失血等)后，當全身性炎性反應已經消退的時候如果出現感染或缺血再灌注損傷等“2次打擊”，機體發生的抗炎性反應抑制了免疫反應，病人對感染失去抵抗，其后果遠較單次打擊更為嚴重。最近關于ALI的基礎研究成功地建立了不同“2次打擊”動物模型［6］。美國國家心肺血液研究小組［7］認為這一研究方法有助于從更加貼近臨床的角度揭示急性呼吸窘迫綜合征的發病機制。本研究結果證明，內毒素復合油酸激活大鼠肺臟TLR2和TLR4，通過一系列細胞內級聯反應，產生大量致炎細胞因子，形成全身性炎性反應，導致嚴重的肺部病理性改變，從而造成比單一打擊本身更大的損傷。

機體通過免疫系統對炎性反應強度進行精細的調節。本世紀初，Borovibova L A等［8］發現副交感神經主要遞質乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)能有效地抑制LPS刺激外周巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor－α，TNF-α)，刺激迷走神經傳出支可抑制大鼠內毒素血癥時的全身炎性反應，因此認為迷走神經及其遞質有抗炎作用［9］。有研究［10］顯示Ach可抑制巨噬細胞中TNF蛋白表達，但對TNF mRNA的轉錄無影響，表明CAP是在轉錄后水平影響細胞內信號轉導過程從而抑制細胞因子合成的。另有研究［11］證實，煙堿可以抑制內毒素引起的NF-κB途徑的活化，但是對于CAP在細胞內通過何種途徑發揮作用至今沒有明確。

本研究RT-PCR結果證實了電刺激迷走神經和靜脈注射THA沒有引起ALI大鼠肺組織TLR2和TLR4mRNA顯著改變，但是可以顯著降低肺組織NF-κBp65和血清IL-6蛋白含量。電刺激迷走神經致使外周神經末梢大量釋放Ach;THA是一種特異性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，它可以抑制膽堿酯酶的降解作用，阻止已釋放的Ach的清除，引起Ach較高濃度的聚集，發揮更強的免疫調節作用。有實驗［12］證明，靜脈注射THA可以減少失血性休克大鼠血漿TNFα和肝組織NF-κB的表達。本實驗證明通過以上兩種方法增加的Ach對致炎物質激活TLRs的作用沒有直接影響，但是可以阻斷其下游的NF-κB活化，使NF-κB不能進入細胞核內進行轉錄，從而減少了炎癥因子的合成和釋放。有研究者［13］檢測了煙堿對內皮細胞NF-κB和NF-κB抑制蛋白家族成員活性的影響，結果顯示，煙堿減少人微血管內皮細胞在TNFα作用后NF-κB的核轉移。因此本研究組認為，CAP是在轉錄前發揮作用的。

本實驗中電刺激迷走神經與靜脈注射THA的作用相似，都增加了具有抗炎作用的遞質Ach的濃度，發揮了CAP更強的免疫調節作用。CAP通過抑制ALI大鼠肺組織NF-κB的活化，減少了IL-6等促炎因子的釋放，使肺組織MPO活性降低，說明中性粒細胞在肺內的扣押減少;ST組和THA組肺組織病理改變較ALI組明顯減輕，W/D值的降低反映了肺組織炎癥滲出減少;血氣分析結果的改善說明缺血缺氧得到緩解。以上實驗觀察均說明電刺激迷走神經或靜脈注射THA通過興奮CAP可以有效抑制LPS復合油酸造成的肺損傷。

綜上所述，本研究得出如下結論:電刺激迷走神經或者靜脈注射他克林可通過激活CAP，減輕LPS復合油酸2次打擊致大鼠ALI時的炎性反應;其可能機制是抑制NF-κB途徑活化，在轉錄前水平發揮抗炎作用，但是不影響ALI時TLR2和TLR4mRNA的活化。

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