不同支架材料體外構建組織工程軟骨的研究

葛平 王正輝 楊壯群 王瑞 溫繡藺

[摘要]目的：體外構建組織工程軟骨，篩選更為適合組織工程軟骨構建的支架材料。方法：體外獲取SD大鼠肋軟骨細胞。采用第一代軟骨細胞作為種子細胞，接種于殼聚糖/明膠和BMG/生物蛋白膠支架，體外培養的不同時間對其進行HE、甲苯胺藍染色、Masson染色、免疫學檢測、掃描電鏡觀察。結果：在培養2周時，BMG/生物蛋白膠各種染色結果顯示軟骨細胞在其表面以及內部分布均勻，蛋白多糖和Ⅱ型膠原染色陽性；殼聚糖/明膠表面細胞稍多于前者，但內部細胞數量極少且分布不均，染色結果不如前者明顯。隨著培養時間的延長各種檢測均顯示有大量的軟骨細胞特異性的蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達，殼聚糖/明膠凸顯出明顯的優勢。結論：體外成功構建組織工程軟骨，軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠上的生長、增殖和分泌基質情況優于殼聚糖/明膠支架。

[關鍵詞]軟骨細胞；組織工程；殼聚糖/明膠；BMG/生物蛋白膠

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）06-0941-04

組織工程概念的提出為修復軟骨組織的缺損提供了一種新的思路和方法。在組織工程軟骨的構建中，大量的生長狀態良好的軟骨細胞以及合適支架材料起著十分關鍵的作用。近年的研究表明多種生物材料均可用于組織工程軟骨的構建，各種材料均有各自的優勢和缺點。我們嘗試將不同的材料進行復合，以彌補各自缺陷更好地構建組織工程軟骨。本實驗采用BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠支架材料復合第一代軟骨細胞，篩選出更適合于構建組織工程軟骨的支架材料。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：高糖DMEM培養基、胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司）；胎牛血清（Invitrogen 公司）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗大鼠，Neomarker 公司）；Aggrecan 單克隆抗體（羊抗大鼠，Santa Cruz 公司）；殼聚糖/明膠（天津中醫藥大學）；BMG（第四軍醫大學骨科）；生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術有限公司）；CO2 孵箱（Thermo 公司，美國）；熒光顯微鏡（Nikon,日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠肋軟骨細胞的培養[1]：SD 大鼠頸椎脫臼法處死，無菌操作臺取其肋軟骨組織，剝離軟骨膜，用眼科剪剪至1mm3左右的組織塊。采用三步法消化，獲得軟骨細胞, 37℃,5%CO2恒溫培養箱中進行培養。傳代培養采用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA（比例為1:1）進行消化，25㎝2培養瓶接種密度為105/ml。本實驗所采用的是第1代肋軟骨細胞。

1.2.2 軟骨細胞-支架復合物的構建

1.2.2.1 殼聚糖/明膠-軟骨細胞復合物的構建：無菌操作條件下，將輻射滅菌的材料取出，置于24孔細胞培養板中。調整軟骨細胞懸液濃度為1.0×107/ml，將50μl細胞懸液加入生物材料中（3mm×3mm×3mm），置于細胞培養箱中孵育4h，以使軟骨細胞附著于生物材料和培養板，加入2ml含20%胎牛血清高糖 DMEM培養液，每天半量更換培養液，共培養8周。

1.2.2.2 BMG /生物蛋白膠-軟骨細胞復合物的構建：將松質骨基質浸泡于DMEM培養液中5min后取出，用滅菌濾紙吸干附在松質骨基質表面和網眼內的水分，浸泡凝血酶后晾干。將纖維蛋白原主體膠與第 1代軟骨細胞混合，制成1×107/ml的細胞懸液，向材料上滴入纖維蛋白原細胞懸液50μl，加入DMEM培養液200μl，靜置于細胞培養箱內10min。將軟骨模塊全部移至在24孔培養板中加入2ml含20%胎牛血清高糖DMEM培養液，置于5%CO2恒溫箱內培養，每天半量更換培養液，共培養8周。

1.2.3 組織學觀察：分別于培養的不同時間點取出組織塊，4%多聚甲醛固定，常規制作切片，行HE、甲苯胺藍、Masson三色染色，光鏡觀察。

1.2.4 免疫學檢測：培養8周的組織塊4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25min，0.01mPBS洗3次，每次5min；滴加一滴3%H2O2（無色液體），消除內源性過氧化物酶活性。0.01m PBS洗滌3次，每次3min；滴加一滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15min，以消除非特異性染色；分別滴加（1:200）Ⅱ型膠原單克隆抗體、aggrecan抗體50μl，4℃冰箱過夜（>18h）；加入用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗，培養箱內，孵育15min；0.01m PBS洗3次，每次5min；避光條件下于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 掃描電鏡觀察：取材培養2、4周的標本各一塊,2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脫水，干燥，送檢掃描電鏡觀察支架材料表面軟骨細胞的黏附以及軟骨細胞的形態結構。

2實驗結果

2.1 組織學觀察結果：2周時可見軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠材料表面以及內部分布均勻，在殼聚糖/明膠材料表面分布的細胞稍多于BMG/生物蛋白膠，但內部的細胞明顯少于材料表面（圖1）。隨著培養時間的延長，殼聚糖/明膠材料表面以及內部細胞數量逐漸增多， 8周時該材料表面可見大量層疊狀軟骨細胞存在，各種染色顯示大量蛋白多糖和Ⅱ型膠原分泌。8周時BMG/生物蛋白膠處于降解階段，材料連續性中斷，軟骨細胞數量及細胞外基質分泌量明顯少于殼聚糖/明膠材料（圖2）。

2.2 免疫熒光檢測

2.2.1 蛋白多糖染色: 8周時可見殼聚糖/材料呈現黃綠色深染，周圍為淡黃色或者黃綠色片染現象，與材料染色有明顯差別，隱約可見軟骨細胞形態（圖3）。而BMG/生物蛋白膠材料為淡黃色或者綠色染色，在材料表面及內部軟骨細胞分布及染色情況清晰可見。

2.2.2 Ⅱ型膠原染色： 8周時殼聚糖/明膠材料熒光染色可見黃綠色深染的為殼聚糖/明膠材料，呈皺折狀，與HE染色形態一致，可明顯辨認，周圍為大量均勻分布的淡黃色或黃綠色片染現象為軟骨細胞分泌特征性Ⅱ型膠原熒光染色情況，隱約可見細胞形態。BMG/生物蛋白膠材料熒光染色見軟骨細胞分泌較多Ⅱ型膠原，染色為黃色或者黃綠色，但細胞數目明顯少于殼聚糖/明膠材料，片狀暈染現象不如后者明顯（圖3）。

2.3 電鏡觀察：2周時可見軟骨細胞黏附于BMG/生物蛋白膠支架材料的表面，細胞單個存在，開始伸展，偽足比較明顯（圖4A）；而殼聚糖/明膠材料表面可見少量的軟骨細胞黏附，細胞呈圓球形，各細胞之間接觸不緊密，細胞之間沒有細胞外基質的存在形態（圖4B）。4周時可見：BMG/生物蛋白膠表面黏附有大量軟骨細胞，但細胞伸展狀態不佳（圖4C）；殼聚糖/明膠材料表面黏附軟骨細胞較少，細胞伸展狀態良好，呈現為長梭形或者樹枝狀，可見明顯的細胞周圍突起偽足以及細胞核形態（圖4D）。

3討論

3.1 松質骨基質（BMG）經過脫鈣、去脂、去蛋白等處理，去掉了除BMP以外 95%非膠原蛋白和有阻滯作用的脂質成分，降低了抗原性[2] ，同時松質骨基質還存留有少量BMP和其他促進骨軟骨形成的內在生長因子[3]。但是單純的松質骨基質對軟骨細胞的吸附力并不強，軟骨細胞不易附在其上，軟骨細胞容易丟失，不易形成軟骨組織。生物蛋白膠又稱為纖維蛋白封閉劑，該物質具有可塑性強，生物相容性好的優點，為組織工程新軟骨形成提供一種可選擇的聚合物支架。Hommniga[4]等已經在實驗中證實兔關節軟骨細胞能在人纖維蛋白凝膠中分裂增殖、合成基質并保持其表型。纖維蛋白膠存在降解速度過快的缺點[5]，筆者嘗試將BMG/生物蛋白膠進行復合，后能夠彌補相互缺陷，更為符合組織工程材料的要求。

3.2 殼聚糖是一種源于動物的天然多糖，與細胞外基質的糖胺聚糖分子結構相似，具有很好的生物相容性[6]。殼聚糖帶有正電荷，使得材料表面與細胞膜之間發生非特異性吸附，從而有利于細胞在材料表面的黏附[7]，且其降解產物對人體無毒副作用[8]。但由于單純的殼聚糖材料親水性較差、降解速度慢等原因，已很難滿足組織工程的需要。許多學者嘗試將殼聚糖材料與多種材料進行復合，均取得了較好的結果[9-11]。由于殼聚糖親水性差，明膠可以促進細胞的黏附和生長，因此本研究考慮殼聚糖復合明膠，形成有利于細胞生長的細胞外基質層結構，可以促進細胞在材料表面的粘附和增殖。

3.3 體外培養8周后，可見兩種材料表面以及內部均有蛋白多糖和Ⅱ型膠原的產生，提示在體外成功構建組織工程軟骨。隨著培養時間的延長，蛋白多糖和Ⅱ型膠原的含量逐漸增多，但殼聚糖/明膠材料更為明顯，各種染色均顯示其陽性染色強于BMG/生物蛋白膠材料組。而培養2周時，常規染色兩種材料表面均有少量軟骨細胞的黏附且細胞分布均勻，殼聚糖材料內部幾乎看不到軟骨細胞的存在，而BMG/生物蛋白膠材料內部可見少量軟骨細胞呈圓形或者橢圓形均勻分布。分析其原因是由于軟骨細胞先與主體膠溶液混合均勻，再與吸附于BMG/生物蛋白膠支架上的凝血酶發生作用，形成纖維蛋白膠，這樣軟骨細胞主要包埋在纖維蛋白膠內，均勻分布于BMG/生物蛋白膠支架表面以及網眼內，從而使軟骨細胞有效地吸附和固定于支架內，不易丟失；采用滴加法將軟骨細胞滴加在殼聚糖/明膠材料上，向材料內部的滲透作用較弱，軟骨細胞主要分布于材料的表面。同時由于材料表面的氧氣和營養比內部更充足，細胞更容易在殼聚糖/明膠材料表面生長，這與張世浩等[15]的研究一致。隨著培養時間的延長，兩種支架材料上細胞的數目均有顯著增加，軟骨細胞逐漸向材料內部生長，分布更為均勻。電鏡觀察BMG/生物蛋白膠表面細胞明顯多于殼聚糖/明膠材料，可能是由于軟骨細胞黏附于殼聚糖/明膠材料的表面，在電鏡樣品制作過程中很容易脫落；但細胞伸展狀態不如殼聚糖/明膠材料，可能是生物蛋白膠材料降解速度過快，導致大量軟骨細胞的丟失，細胞數量減少，細胞外基質分泌減少，使各細胞之間的連接、相互影響顯著降低[11]。

3.4 軟骨細胞在BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠材料上均能良好的生長，增殖。表明BMG/生物蛋白膠和殼聚糖/明膠材料均適合作為組織工程軟骨的支架材料，但體外研究表明殼聚糖/明膠材料優于BMG/生物蛋白膠材料，其具體機制還需進一步進行體內實驗。

[參考文獻]

[1]楊壯群,劉利峰,曹峻嶺,等.胰島素樣生長因子對體外培養豚鼠肋軟骨細胞的影響[J].中國美容醫學,2005,14(1):9-11.

[2]Hu XB,Yao LL,Lu CZ,et al. Experimental and clinical investigations of human insoluble bone matrix gelatin[J]. Clin Orthop,1993,293:360-365.

[3]宋紅星,劉森,李佛保,等.松質骨骨基質明膠負載軟骨細胞體外培養的實驗研究[J].骨與關節損傷雜志,2002,17(1):37-39.

[4]Homminga GN, Buma B, Koot HW, et al.Chondrocyte behavior in fibrin giue in vitro[J].Acta OrthopScand,1993,64(4):441-44.

[5]楊淵,陳學忠,肖增明,等,生物蛋白膠/松質骨基質負載軟骨細胞體外培養的實驗研究[J].廣西醫學,2006,28(9):1331-1333.

[6]方佩斐,賈維敏.組織工程中天然支架材料的研究現狀[J].醫學文選,2006,25(4):901-903.

[7]Kim HK, Moran ME, Salter RB. The potential for regeneration of articμlar cartilage in defects created by chondral shaving and subchondral abrasion. An experimental investigation in rabbits[J].J Bone Joint Surg,1991,73(9):1301-1315.

[8]李立華,李 紅,羅丙紅,等.殼聚糖及其衍生物在組織工程中的應用[J].功能高分子學報,2005, 18(2):347-352.

[9]覃昱,裴國獻,謝德明,等.殼聚糖海藻酸鈉微球與骨髓基質細胞相容性實驗研究[J].中國矯形外科雜志,2003,11(13):901-903.

[10]Chen YL,Lee HP,Chan HY,et al.Composite chondroitin -6-sulfate/ dermatan sulfate/chitosan scaffolds for cartilage tissue engineering[J].Biomaterials,2007,28:2294-2305.

[11]Plaas AHK,Wong-Palms S,Roughley PJ,et al. Chemical and immunological assay of the nonreducing terminal residues of chondroitin sulfate from human aggrecan[J].Biol Chem ,1997,272,(20):603-610.

[12]Bini TB,Gao S,Wang S,et al. Development of fibrous biodegradable polymer conduits for guided nerve regeneration[J]. Mater Sci Mater Med,2005,16(4):367-375.

[收稿日期]2011-12-10[修回日期]2012-02-28

編輯/張惠娟