便秘模型小鼠皮膚老化的觀察

彭圓 程靜 李偉 嚴進 田代志 郭嵐 王平

[摘要]目的：觀察便秘模型小鼠的皮膚老化,為肺與大腸相表里的歸經藥物研究提供動物模型。方法：以空白組和D-半乳糖致衰模型作對照，采用限水（1.5ml/天），疊加復方地芬諾酯(10mg/kg·d)灌胃6周建立便秘模型。通過小腸墨汁推進率、大腸和皮膚含水率判斷便秘模型是否成功，同時進行血清、皮和肺超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、皮膚組織羥脯氨酸(Hydroproline，HYP)及透明質酸（Hyaluronic acid,HA）含量、皮膚的光鏡檢測。結果：與空白組比較，便秘組各項指標顯示有顯著性差異（P<0.01）。小腸推進率明顯下降（P<0.01）；大腸和皮膚含水率下降（P<0.01）；皮膚明顯變薄，膠原纖維數量減少；血清、皮膚及肺組織中SOD活力明顯下降（P<0.01），皮膚組織中HYP含量減少（P<0.01）；皮膚組織勻漿中HA含量銳減（P<0.01）。與衰老模型組比較，無顯著性差異。結論：便秘可導致皮膚衰老。抗氧化能力下降與皮膚組織HA含量減少可能是該便秘模型小鼠皮膚菲薄、干燥的病理機制。

[關鍵詞]便秘；皮膚；衰老；小鼠模型

[中圖分類號]R332R758 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）06-0947-03

衰老與便秘相關，已為歷代醫家所論述。如《論衡》中有“欲得長生，腸中常清；欲得不死，腸中無滓”。《扁鵲心書·便閉》：“老人氣虛，及婦人產后血少，致津液不行，不得通流，故大便常結。”《醫宗必讀》云:“老年津液干枯…皆能便結”等。各種原因引起的便秘，其病位雖在大腸，由于五臟一體觀之肺系統中大腸、皮毛與肺互為聯絡，如《素問·五臟生成》云：“肺之合皮也，其榮毛也”。《靈樞·本藏》曰: “肺合大腸, 大腸者, 皮其應”。《靈樞·本輸》云：“肺合大腸。大腸者，傳導之官”。故而大腸的病變常與肺的病變相關聯，同時“肺與皮毛相合”，肺與皮膚的病變也常互為影響，所以大腸與皮膚在病理上也有緊密的聯系。盡管近年來，對“肺與大腸相表里”的理論認識在不斷加深，但從皮膚衰老角度進行其相關性研究并不多見。因此本研究以便秘模型動物為對象，觀察其皮膚的老化現象，旨為肺與大腸相表里的歸經藥物研究提供動物模型。

1材料和方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 動物：2月齡昆明清潔級小鼠62只，（20±2）g，雌雄各半，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物研究中心，標準飼料喂養。

1.1.2 藥品：復方地芬諾酯(10mg/ kg·d)，江蘇平光制藥有限責任公司；D-半乳糖，張家港市華昌藥業有限公司，用超純水配成濃度為10%， 4℃冷藏備用。

1.1.3 主要器材：AL104型電子天平；DHG90A系列鼓風干燥箱；721型分光光度計； FSH-Ⅱ型可調高速電動勻漿機；TGL-16G-A型低溫離心機(AnKe)；GC-1200r放免計數儀；RM2135 型旋轉切片機；TB-718E型生物組織自動包埋機；Motic BA300數碼光學顯微鏡。

1.1.4 主要試劑:超氧化物歧化酶（SOD）、羥脯氨酸（HYP）、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。透明質酸放射免疫分析檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所。蘇木素液、伊紅染色液、乙醇、二甲苯、多聚甲醛購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組造模與處理: 將62只2月齡昆明清潔級小鼠，稱重后按性別隨機分為空白組、便秘組、衰老組。用苦味酸標記。其中便秘組22只，其余組各20只。空白組常規攝食、飲水及光照。衰老組參照文獻[1]按1000mg/kg·d于頸背部皮下注射D-半乳糖，制備亞急性衰老動物模型。便秘組參照文獻[2-3]略做改進，采用限水（正常小鼠日需水量的1/3即1.5ml），疊加復方地芬諾酯(10mg/kg·d)灌胃建立復合便秘模型，灌胃順序依次為超純水（20ml/kg·d）、復方地芬諾酯（10ml/ kg·d）、超純水（補充余量），間隔3h；空白組以超純水做對照；共6周。實驗過程中便秘組有2只死亡。

實驗結束后于第43天每組一半做墨汁推進實驗，另一半做其余實驗。行眼眶取血，常規離心制備血清；行兩肩胛至兩髂骨之間的備皮，在冰上取備皮后的背部皮膚組織塊和開胸后肺組織, 制備10%組織勻漿，-20℃冰箱貯存備用；剪取上自回盲部、下至直腸的腸管，去除內容物后用萬分之一電子天平精確稱其濕重；在冰上取背部2cm×2cm大小皮膚，用萬分之一電子天平精確稱其濕重；取背部正中0.5cm×0.5cm大小皮膚，迅速放入4％多聚甲醛中固定進行形態學觀察。

1.3 標本制備及檢測

1.3.1 小腸墨汁推進功能檢測(墨汁推進實驗)：在實驗結束后禁食20h。將墨汁與各組灌胃的液體物質按1：2體積比配制。參照文獻[4]，計算墨汁推進率(%)=〔墨汁推進長度(cm)/小腸總長度(cm)〕×100%。

1.3.2 大腸及皮膚含水率實驗：稱濕重后的腸管放到80℃干燥箱中烘3h至恒重，稱取干重；將稱濕重后的皮膚放到80℃干燥箱中烘12h，稱取干重，計算組織含水率。組織含水率(%)=（組織濕重-組織干重）／組織濕重×100%。

1.3.3血清、皮膚及肺組織SOD活性檢測：采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性測定。考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒并檢測皮膚蛋白含量。

1.3.4 皮膚HYP含量及透明質酸含量的測定：采用樣本堿水解法檢測HYP含量。由湖北中醫附院核醫學科采用放免法測定HA含量。

1.3.5皮膚組織學觀察：固定24h后常規脫水、透明、浸蠟、包埋，石蠟切片、脫蠟、脫水、HE染色，光鏡下觀察，顯微攝影（攝像頭：MOTICAM 3000）。

1.4 統計學處理：采用SPSS15.0 for Windows 軟件包進行數據分析。數據用 表示，組間比較用方差分析并用最小顯著差法(LSD)做兩兩比較。當各組方差不齊時用Dunnetts''''C法做兩兩比較。

2結果

2.1 便秘模型小鼠腸道傳輸功能及含水實驗、皮膚含水功能檢測：見表1，可以看出,與空白組比較，便秘組小腸墨汁推進率、大腸含水率、皮膚組織含水率及皮膚HA均顯著降低（P<0.01）。便秘組與衰老組比較，無顯著性差異。

2.2 便秘模型小鼠抗氧化能力檢測：見表2，可以看出,與空白組比較，便秘組血清中SOD活性顯著降低（P<0.01）；皮膚SOD活性、羥脯氨酸含量均顯著降低（P<0.01）；肺SOD活性均顯著降低（P<0.01）。便秘組與衰老組比較，無顯著性差異。

2.3 皮膚組織HE染色結果：空白組小鼠皮膚結構完整。表皮與真皮界線清晰，表皮薄，較規則；真皮層厚，膠原纖維豐富交錯排列，大量成纖維細胞可見；皮下未見脂肪細胞填充。與空白組比較，衰老組小鼠皮膚變薄，結構完整。表皮薄，真皮膠原纖維數量減少，成纖維細胞數量減少，皮下脂肪層細胞填充明顯增多，厚達6～9層。與空白組比較，便秘組小鼠皮膚變薄，結構完整。表皮薄，真皮膠原纖維數量減少，成纖維細胞數量減少，皮下脂肪細胞填充較少，僅1～2層。

3討論

3.1 由于機體本身的代償機制存在，當短期限水或禁水時，容易自然恢復，故本課題在借鑒前人研究成果的基礎上,對復方地芬諾酯模型和短期限水模型加以改進，建立連續6周限水（僅維持小鼠正常日需水量的1/3）加大劑量復方地芬諾酯（10mg/ kg·d）并用的復合便秘模型。結果顯示該模型小鼠已出現明顯的小腸墨汁推進率與大腸含水的降低，可見復合因素造模后，模型動物出現了腸道傳輸功能明顯下降，大腸含水量顯著降低。不僅如此，皮膚含水量也明顯減少。這與臨床腸燥津虧證的一般特點如皮膚干燥、大便干結難解等類似。對皮膚含水功能進一步的研究發現模型鼠皮膚中HA含量明顯減少，可能是導致皮膚組織含水減少，出現皮膚干燥變薄表象的原因之一。

3.2 現代醫學研究表明，便秘不僅使消化道處于創傷應激中心地位，還可加劇體內的氧自由基反應和脂質過氧化反應，削弱機體對抗自由基的能力[5]，這與本實驗抗氧化能力結果一致。其中血清與肺SOD活性檢測的結果提示，模型鼠對抗氧自由基的能力銳減，使暴露于有氧環境中肺成為氧化應激發生的一個重要位點，從而參與機體衰老的發展進程。

3.3 大量流行病學、臨床和實驗研究支持氧化應激損傷是皮膚衰老主要機制之一[6-8]。本研究抗氧化能力的結果還顯示，模型鼠皮膚SOD 活性明顯下降，皮膚HYP含量顯著降低，且與鏡下皮膚變薄真皮膠原纖維數量減少的形態學變化結果保持一致，表明便秘模型動物體內呈現出明顯的氧化應激反應。其抗氧化防御能力的下降，是導致皮膚細胞損傷加劇、皮膚老化的一大機制。

3.4 中醫認為人體是一個有機整體。“藏之于內必象之于外”，通過觀測皮膚改變，可以洞察體內臟腑的功能狀態。本實驗通過皮膚組織形態學觀察及定量分析和皮膚抗衰老指標的檢測，結果證明，該模型小鼠皮膚中各項指標變化與D-半乳糖致亞急性衰老模型皮膚的改變相一致,無顯著性差別，從而說明便秘可以導致衰老，可成為皮膚衰老的一大誘因。

綜上所述，本實驗通過復方地芬諾酯灌胃疊加飲水限制，造成了與臨床相符的腸燥津虧證便秘動物模型。抗氧化能力下降與皮膚組織HA含量減少可能是該便秘模型小鼠皮膚菲薄、干燥的病理機制。基于大腸、皮毛與肺互為聯絡關系，本模型從皮膚衰老角度初步為“肺與大腸相表里”研究提供了新思路，值得深入“肺與大腸相表里”的歸經藥物研究。

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[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-07

編輯/張惠娟