白介素-1對培養人表皮黑素細胞增殖及黑素合成的影響研究

林新瑜 王芳 林鴻剛 段西凌

[摘要]目的： 建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系, 觀察不同濃度的白介素-1α，白介素-1β對體外培養正常人黑素細胞的細胞增殖及黑素合成的影響。方法：采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定白介素-1α及白介素-1β對黑素細胞增值的影響，NaOH裂解法測定黑素生成量，流式細胞儀檢測黑素細胞的凋亡率。結果：白介素-1α及白介素-1β對黑素細胞活力有抑制作用,能使細胞增殖能力降低,黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率。結論：白介素-1α及白介素-1β對體外培養的黑素細胞增殖及黑素生成都有抑制作用, 這為臨床應用白介素-1α及白介素-1β治療色素性疾病提供了實驗依據。

[關鍵詞]白介素-1α；白介素-1β；黑素細胞

[中圖分類號]R758[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）06-0952-04

黑素的合成是個極其復雜的過程,在體內受金屬離子、細胞因子、激素等各種因素的調節。多種細胞因子對于黑素細胞的數量、形態、酪氨酸酶活性、細胞間粘附分子-1等均有不同程度的影響[1]。IL-1是一個多功能的促炎癥細胞因子家族,幾乎所有有核細胞均能產生IL-1。為了研究白介素-1（Interleutin-1, IL-1）對人表皮黑素細胞增殖及黑素合成的影響，為臨床應用IL-1治療色素性疾病提供實驗依據，筆者建立了正常人表皮黑素細胞體外培養體系，采用不同濃度的白介素-1α及白介素-1β作用于體外培養的黑素細胞, 觀察了IL-1α及IL-1β對表皮黑素細胞增殖及黑素合成的調節作用, 現將結果報道如下。

1材料和方法

1.1 材料及儀器：MCDB-153培養基，牛胰島素，人轉鐵蛋白，L-Dopa, IL-1α，IL-1β，DMSO，MTT 均購自美國Sigma公司。重組人表皮生長因子( rhEGF)購于美國Peprotech公司。牛垂體提取物(BPE)購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。EDTA-Na2購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100IU/ml，鏈霉素100IU/ml，胰蛋白酶，苔盼蘭均系國產。培養瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司；顯微鏡：觀察細胞用的是OLYMPUSCK2型號；細胞計數用的是OLYMPUSCKX41型號， 照相用的OLYMPUSCH2型號；酶聯免疫檢測儀；流式細胞儀。標本經患者知情同意后取自18～35歲行包皮環切術的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細胞的培養[2-3]：將上述包皮標本消毒、修剪,用含0.2g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化和離心后,將獲得的MC 進行培養。在倒置顯微鏡下觀察, 細胞呈明顯的兩極或多極樹突形態。

1.2.2 黑素細胞鑒定[4-5]

1.2.2.1L-Dopa染色：將傳代純化后的黑素細胞，經含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接種于已預先放置蓋玻片的 6 孔板內，待細胞貼壁并穩定生長后棄去培養液，并用預熱的PBS液洗滌數次。用2.5g/L戊二醛固定后，加入用黑素細胞培養液配制的1g/L L-Dopa，37℃ 孵育4h，其間換液1次，風干后甘油封片，照相。

1.2.2.2Fontana銀染：在0.15%硝酸銀溶液中加入適量氨水配制成氨銀液，將傳代純化的黑素細胞用戊二醛固定后加入氨銀液，避光浸染約30min，PBS液漂洗3次后置倒置顯微鏡下觀察，照相。

1.2.2.3S-100 蛋白免疫組化染色：將傳代純化后的黑素細胞，經消化后接種于已預先放置蓋玻片的 6 孔培養板內，待細胞貼壁后去掉培養液。用2.5g/L 戊二醛固定后，PBS液洗滌數次，加入3%的H2O2，室溫30min，以去除內源性過氧化物酶；再次用PBS液洗滌數次，滴加1：20稀釋的羊血清，室溫下處理15min；加入1:200兔抗 S-100蛋白的多克隆抗體，4℃ 過夜；洗滌后加入生物素標記的羊抗兔抗體，37℃、濕盒孵育1h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃、濕盒孵育1h。洗滌后DAB染色，蒸餾水適時終止，蘇木素復染后用加拿大膠封片，照相。

1.2.3 黑素細胞增殖的測定：采用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT法）。 倒置顯微鏡下觀察，細胞培養至80%匯合時，棄培養液上清，加入含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5ml，在75cm2的細胞培養瓶內37℃孵育3～5 min，鏡下觀察約80%脫落，加入5ml左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培養基終止消化，轉移細胞懸液到15ml離心管，1 500rpm離心3min，棄去上清，加入適量含有10%血清的MDCB-153培養基重懸細胞團塊，吸取100μl到一個無菌的500μl的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼蘭溶液，室溫下混勻5min，吸取100μl混合液于血細胞計數板計數。按20000個/ml接種到96孔板中，每孔150μl，37℃，5%CO2孵箱過夜培養。

第二天，棄去培養基上清，加入新鮮的MDCB-153培養基100μl /孔，備用。以無菌PBS配置的IL-1α，IL-1β溶液，其終濃度分別為50，100，200ng/ml，備用。無菌加入100μl相應濃度的IL-1α，IL-1β溶液，同時設立PBS和空白對照組，各個濃度各設5個復孔。處理后分別培養24h，48h，72h。相應處理時間后，分別棄去培養基上清，加入含MTT終濃度為0.5mg/ml的新鮮MDCB-153培養基繼續培養4h，800rpm離心3min，棄去培養基上清，加入150μl的DMSO溶解甲瓚，37℃孵育15min，于波長為495nm處測吸光度值，記錄數據，按公式計算其抑制率。抑制率=（對照組-實驗組）/對照組x100%。

1.2.4黑素合成的測定：采用NAOH法。將處理后的黑素細胞棄去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min后，分別計數后調整細胞數目，取等數量的細胞離心后重懸于100μl的0.5mmol/L的NAOH溶液中， 37℃孵育1h后，各管加入400μl的蒸餾水稀釋后，分別于405nm處和450nm測量吸光度值，按公式計算其抑制率。黑素合成抑制率 =[1-(藥物孔吸光度值÷藥物孔細胞密度)÷(對照孔吸光度值÷對照孔細胞密度)]×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測：細胞培養，計數等如前，按2×105/孔接種到6孔板，濃度100ng/ml的IL-1α處理組，IL-1β處理組和PBS組，空白對照組設置如前，細胞處理72h后，分別收集培養基上清到離心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，消化終止如前。分別收集細胞懸液轉到相應的已經收集有各自上清的離心管里，1500rpm離心3min，棄去上清，加入無菌的PBS重懸細胞團塊，1500rpm離心3min，重復3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30min，上機檢測。

1.3 統計學處理：全部數據采用 SPSS 統計軟件10.0版進行分析。

2結果

2.1 形態學結果：體外培養的正常人黑素細胞為雙極、 三極和多極的樹突狀細胞，細胞增殖良好,細胞樹突之間交織成網 (見圖 1)。

2.2 黑素細胞鑒定

2.2.1 L-Dopa染色：第3代黑素細胞經0.1 %L-Dopa染色后鏡下見黑素細胞胞質及樹突均被染成灰黑色 (見圖2)。

2.2.2Fontana銀染：第3代黑素細胞經氨銀液避光浸染30min，細胞被染成黑色（見圖3）。

2.2.3 S-100蛋白染色：黑素細胞胞質及樹突呈棕黃色陽性著色,從而可以鑒定為黑素細胞(見圖4)。

2.3 不同濃度IL-1α對人正常皮膚黑素細胞增殖率(%)的影響：黑素細胞增殖的測定結果見表1。各濃度IL-1α實驗組對黑素細胞的抑制率較PBS對照組相比有統計學意義(P <0.05#或P<0.01*) 。從表1中可以看出隨作用時間增加，黑素細胞抑制率逐漸增加，而且隨IL-1的濃度增加，黑素細胞的抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細胞的作用呈現出時間和劑量的相關性。

2.4 不同濃度IL-1β對人正常皮膚黑素細胞增殖率(%)的影響：黑素細胞增殖的測定結果見表2。各濃度IL-1β實驗組對黑素細胞的抑制率較PBS對照組相比有統計學意義(P <0.05#或P<0.01*) 。從表2中可以看出隨作用時間增加，黑素細胞抑制率逐漸增加，而且隨IL-1β的濃度增加，黑素細胞的抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細胞的作用呈現出時間和劑量的相關性。

2.5黑素合成的測定結果：見表3。405nm處和450nm處分別測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率，均可見IL-1α及IL-1β作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-1α及IL-1β組與PBS組比較統計學上均有顯著性差異（P<0.05#），但IL-1α及IL-1β兩組之間比較統計學上無顯著性差異（P＞0.05）。

2.6流式細胞術檢測：濃度為100ng/ml 的IL-1α及IL-1β作用于黑素細胞72h后用流式細胞術檢測的結果：空白對照組黑素細胞凋亡率為5.5%，溶劑PBS組黑素細胞凋亡率為6.7%，IL-1α（100ng/ml）組黑素細胞凋亡率為57.3%。IL-1β（100ng/ml）組黑素細胞凋亡率為56.6%。IL-1α（100ng/ml）組黑素細胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統計學意義（P<0.01）。IL-1β（100ng/ml）組黑素細胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異也有統計學意義（P <0.01）。但IL-1α及IL-1β兩組之間黑素細胞凋亡率的比較統計學上無顯著性差異（P＞0.05）。

3討論

IL-1 家族有3個主要成員, IL-1α、IL-1β和IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)。IL-1具有介導炎癥反應、 促進 T細胞和B 細胞的增殖與分化 ,參與免疫調節、 影響代謝、 刺激造血細胞及引起發熱等多種生物學作用[6]。人類皮膚內的IL-1主要形式是IL-1α, IL-1β是次要形式[6-7]。Swope[8]等研究發現IL-1、 IL-6及TNF-α三種細胞因子可抑制培養黑素細胞的酪氨酸酶活性,其中IL-1最為明顯,此外它們還能抑制黑素細胞的生長，但無細胞毒性作用,故認為它們可能是阻礙黑素細胞黑素生成的重要因素。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系后 , 用不同濃度的IL-1α和IL-1β作用于黑素細胞后也發現IL-1α、IL-1β對黑素細胞活力有抑制作用 ,能使細胞增殖力降低,兩者存在明顯的劑量和時間效應。濃度越高，抑制率越強，與 Swope等[8]的研究一致。本研究還發現IL-1α、IL-1β還可導致黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率。顧勁松等[9]采用放射免疫分析法測定白癜風患者血清細胞因子水平，泛發性患者血清IL-1β水平均顯著高于對照組。Lu Y等[10]學者用角質形成細胞分泌的IL-1處理黑素細胞發現可以刺激括細胞間黏附分子-1的顯著表達。LePoole等[11]觀察到, 白癜風患者皮損處黑素細胞周圍基質中, 細胞間黏附分子表達明顯增高，高表達的細胞間黏附分子可以顯著抑制黑素細胞與纖維粘連蛋白的黏附, 導致黑素細胞缺失。IL-1作為多功能的促炎癥細胞因子,是否為參與引起炎癥后色素脫失的主要因素，在白癜風的發病過程中起著怎樣的作用， IL-1α、IL-1β究竟是通過什么通路和機制達到這些作用還有待進一步的深入研究。

[參考文獻]

[1]李紅,朱文元.細胞因子對黑素細胞生物學特性的影響[J].國外醫學皮膚性病學分冊,1996,22（4）:219-221.

[2]Tsuji T, Karasek M. A procedure for the isolation of primary culture of melanocyte from new born and adult human skin[J].J Invest dermal,1983,81（2）,179-181.

[3]項蕾紅,鄭志忠,祝綠川,等.黑素細胞體外純培養及生物學特性鑒定[J].臨床皮膚科雜志, 2001,30（3）:166-167

[4]楊壯群,王正輝,荔 鵬,等. 蘆薈苦素對體外培養的黑素細胞影響的實驗研究[J].中國美容醫學,2003,12（5）:464-466.

[5]陳菊萍,冉玉平,魏大鵬,等.人黑素細胞培養最佳條件的選擇和生物學鑒定[J].中國麻風皮膚病雜志,2007,23（3）:214-216.

[6]Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease[J].Blood,1996,87（6）:2095-2147.

[7]Kupper TS,Groves RW.The interleukin-1 axis and cutaneous inflammation[J].J Invest Dermatol,1995,105（1Suppl）:S62-S66.

[8]Swope VB,Abdel- Malek Z,Massem LM,et al. Interleukin 1 alpha and 6 and tumor necrosis factor-alpha are paracrine inhibitors of human melanocyte proliferation and melanogenesis[J].J Invest Dermatol,1991,96（2）:180-185.

[9]顧勁松,涂彩霞,譚雪晶,等.白癜風患者血清白介素、腫瘤壞死因子α及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子檢測[J].中華皮膚科雜志,2003,36（2）:73-75.

[10]Lu Y,Zhu WY,Tan C,et al.Melanocytes are potential immunocompetent cells: evidence from recognition of immunological characteristics of cultured human mel anocytes[J].Pigment Cell Res,2002,15（6）:454-460.

[11]LePoole IC,vanden Wijngaard RM, Westerhof W,et al.Tenascin is overexpressedin vitiligo lesional skin and inhibits melanocyte adhesion[J].Br J Dermatol,1997,137（2）: 171-178.

[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-03

編輯/張惠娟