基因工程中限制酶切割的幾個(gè)問題

張玉林

限制酶全稱限制性核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別并切割具有特異序列的雙鏈DNA分子，主要從原核細(xì)胞中分離純化而來，迄今為止，已分離出來的限制酶約有4 000余種。作為基因工程中非常重要的一種工具，它應(yīng)用廣泛，是歷年高考中能力題的命題著力點(diǎn)，但由于書本相關(guān)內(nèi)容介紹簡單，而考試命題時(shí)常有所拓展，很多師生在解答此類題目時(shí)常發(fā)生認(rèn)知沖突，產(chǎn)生很大的困惑，為此，筆者總結(jié)了教學(xué)過程中的一些問題，供大家參考。

1 限制酶能將外來的DNA切斷，使之失去活力，對自己的DNA卻無損害作用的原因

在人教版《生物·必修2·遺傳與進(jìn)化》中，關(guān)于“T2噬菌體侵染細(xì)菌”的實(shí)驗(yàn)就已經(jīng)告訴我們，原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，這一點(diǎn)學(xué)生很容易理解并接受，但對于原核生物細(xì)胞內(nèi)的限制酶只切割外源DNA，而不切割自身DNA，卻難以理解。

在長期的進(jìn)化過程中原核生物形成了一套完善的防御機(jī)制，以保持自身遺傳的相對穩(wěn)定性。當(dāng)外源DNA侵入后，限制酶就將其切割掉，使外源DNA不能發(fā)揮遺傳效應(yīng)，但限制性內(nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時(shí)成對存在，它們具有相同的底物專一性，具有識(shí)別相同堿基序列能力。甲基化酶的甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸，甲基受體為DNA上的腺嘌呤與胞嘧啶。當(dāng)限制酶作用位點(diǎn)上的某一些堿基被甲基化修飾后，限制酶就不能再降解這種DNA了，所以限制性內(nèi)切酶只降解外源入侵的異種DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遺傳干擾的同時(shí)又保護(hù)了自身遺傳特性的穩(wěn)定。

2 一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列嗎

在人教版《生物·必修2·遺傳與進(jìn)化》P102中，明確指出：“一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子”，但真實(shí)情況卻并非如此，有少數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別兩種以上的核苷酸序列。如HindⅡ的識(shí)別序列為5′…GTPy↓PuAC…3′，其中Py=C或T；Pu=A或G。這樣HindⅡ的識(shí)別序列實(shí)際為四種，如圖1所示。

3 不同種類的限制酶識(shí)別的核苷酸序列一定不同嗎，切割位點(diǎn)一定不同嗎

有一些限制酶雖然來源不同，但識(shí)別的是同樣的核苷酸序列，這類酶稱為同裂酶，而同裂酶的切點(diǎn)位置可能相同，也可能不同，如圖2和圖3所示。

（1） 切點(diǎn)位置相同：

（2） 切點(diǎn)位置不相同：

4 如果不同種類的限制酶分別識(shí)別不同的核苷酸序列，是否一定產(chǎn)生不同的黏性末端

有些限制酶雖然來源各異，識(shí)別的靶序列也不相同，但切割雙鏈DNA后卻可以產(chǎn)生相同的黏性末端，這一類限制酶稱為同尾酶，如圖4所示。

值得注意的是，BamHⅠ和BglⅡ切割DNA后雖然產(chǎn)生了相同的黏性末端，但如果這樣的黏性末端相結(jié)合，將不能再被BamHⅠ或BglⅡ識(shí)別并切割。

5 構(gòu)建酶切圖譜時(shí)，確定限制酶切點(diǎn)位置的方法

人們?yōu)榱肆私饣虻慕Y(jié)構(gòu)，通常選取某一特定長度的DNA分子，用多種限制酶單獨(dú)或聯(lián)合切割，再通過電泳技術(shù)將酶切片段進(jìn)行分離，計(jì)算相對大小，以確定每一種限制酶在DNA分子中的切點(diǎn)位置和相對距離，即構(gòu)建酶切圖譜，一般以直線或環(huán)狀圖式表示。酶切圖譜的構(gòu)建在DNA序列分析、基因文庫的構(gòu)建等工作中具有重要意義，那究竟如何構(gòu)建酶切圖譜呢？例如用限制酶EcoRV、MboⅠ單獨(dú)或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段長度如圖5所示。

質(zhì)粒為環(huán)狀雙鏈DNA分子，一次切割只能產(chǎn)生一個(gè)片段，故EcoRV切點(diǎn)數(shù)目為1，MboⅠ切點(diǎn)數(shù)目為2。將單酶切片段與雙酶切片段逐一比較，繪制酶切圖譜。圖5中MboⅠ切割后產(chǎn)生一個(gè)大片段11.5 kb與雙酶切產(chǎn)生的5.5 kb和6 kb重疊，確定EcoRV的切點(diǎn)位置在11.5 kb中。因此給出的質(zhì)粒及酶切位點(diǎn)如圖6所示。