MAPK和PI3K調節缺氧誘導因子 2α對慢性阻塞性肺疾病的作用

孔春初　戴愛國

[摘要] 目的 探討缺氧誘導因子2α（HIF-2α）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K） 的表達變化在缺氧性肺動脈高壓（HPH）中的作用和意義。 方法 選擇COPD患者（24例）和非COPD對照組（28例）患者為研究對象，行HE染色檢測兩組患者肺小動脈形態學改變，應用免疫組化檢測肺小動脈壁內P-AKT、P-ERK、P-JNK、P-P38表達水平，應用原位雜交和免疫組化檢測肺小動脈壁內HIF-2α的表達水平。 結果 COPD患者管壁面積與管總面積比值及肺小血管中膜厚度均較對照組增高（P < 0.01）。COPD患者肺小血管壁P-ERK以及P-AKT和HIF-2α基因表達水平較對照組患者肺血管壁內增強，而P-JNK、 P-P38表達水平較對照無明顯變化。 結論 MAPK信號通路和磷酸肌醇3－激酶（PI3K）信號通路以及HIF-2α可能參與了COPD患者HPH的發生。

[關鍵詞] 絲裂原活化蛋白激酶；磷酸肌醇3－激酶；缺氧誘導因子2α；缺氧；高血壓，肺性

[中圖分類號] R563.9[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）21-0001-03

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。COPD主要累及肺臟，但也可引起全身（或稱肺外）的不良反應，長期COPD患者因氣流長期受限多存在低氧血癥，肺小動脈痙攣，結構重塑，最終導致肺動脈壓力增高，肺血管阻力增加，左心代償性肥厚，進行導致慢性肺心病。HIF-2α是機體低氧適應反應過程中的關鍵性轉錄因子，由α功能亞基 （HIF-2α）和β結構亞基（HIF-2β）組成[1-2]，可與下游目的基因的低氧反應元件（HRE）結合，促進低氧反應基因的轉錄來適應低氧狀態。筆者前期的研究提示，HIF-2α參與 COPD的肺血管重塑，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路調控HIF 在缺氧大鼠HPSR 形成中有重要作用[3-4]。本研究通過觀察COPD患者肺小動脈壁內HIF-2α與P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt的表達變化，從而探討其在HPH發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖南省老年醫院胸外科2008年1～12月收治的行肺葉切除術患者52例，原發病為支氣管擴張、肺癌、肺炎性假瘤、肺結核等。全部患者術前均進行體檢、肺功能檢查、胸部CT、X線檢查，并結合病史進行診斷。其中COPD患者24例，非COPD患者28例，COPD的診斷符合2002年合中華醫學會標準。COPD組24例患者中，男16例，女8例，年齡（61±5）歲，其中輕度5例，中度7例，第一秒用力呼氣容積（FEV1）占預計百分比為（68±7.1）%，切除標本的位置位于肺右下葉7例，左上葉5例；對照組（無COPD者）28例，其中男18例，女10例，年齡（59±7）歲，切除標本的位置位于右下葉8例，左上葉6例，FEV1占預計百分比為（90±4.5）%。兩組患者的性別、年齡、標本位置比較，差異無統計學意義。

1.2 免疫組化實驗

切除標本采用中性甲醛固定12 h，行常規石蠟包埋切片，然后在37℃溫控下采用0.125%胰蛋白酶消化20 min后行抗原修復，加入一抗體，抗體主要有小鼠抗人HIF－2α，P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt 單克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司，1∶100 稀釋）；即用型兔抗人iNOS 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司生產），設定溫度為 4℃，孵育過夜，采用福州邁新生物技術開發公司生產的超敏S-P試劑盒，嚴格按使用說明書操作，先后行DAB 顯色，蘇木素復染。設置陰性對照，加入試劑為PBS（代替一抗）。

1.3 原位雜交實驗

原位雜交的前期暴露mRNA的標本處理同免疫組化檢查加入抗體前的操作步驟，預雜交溫度為40℃，預雜交時間為2 h，2 h后加入HIF－2α mRNA 探針（高辛標記的多相寡核苷酸探針），探針序列依次為：（1）5''-CGAAC ACATA AACTC CTGTC TTCAG TGTGC-3''；（2）5''-ATCCG AGAGA ACCTG ACACT CAAAA CTGGC-3''；（3）5''-GGGCA AGTGA GAGTC TACAA CAACT GCCCC-3''。設定雜交溫度為38℃，時間為12 h，過夜后檢測雜交結果，檢測方法采用武漢博士德生物工程公司生產的原位雜交檢測試劑盒，操作步驟嚴格按說明書進行。設置陰性對照，對照標本在雜交實驗中加入空白雜交液（代替探針）。

1.4 結果判斷與統計學分析

染色結果判斷，光學顯微鏡下觀察標本背景顏色判斷染色結果，背影無明顯染色為陰性（-）；背景染色為淡黃色提示弱陽性（+）；背景染色為黃色提示陽性（++），背景染色為深黃色或棕色則提示為強陽性（+++）。每位患者的切片標本均選擇3條肺動脈，觀察其染色情況，并進行比較，統計方法采用Ridit 分析及卡方檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織構型觀察

COPD 患者肺部出現巨噬細胞炎性浸潤，肺泡隔纖維組織增生，支氣管壁增厚，肺部微動脈管壁平滑肌層顯著增生，微血管管壁明顯增厚，導致管腔變窄。對照組患者肺組織標本顯示除部分存在炎癥細胞浸潤外，肺血管、支氣管、微血管及官腔未見明顯異常。

2.2 HIF－2α mRNA表達

COPD 患者肺組織標本染色顯示，肺部炎癥細胞、部分肺泡上皮細胞及部分肺動脈壁細胞HIF－2α mRNA和蛋白質染色呈強陽性，其余部位HIF－2αm RNA和蛋白質染色均呈陽性（圖2、4）。對照組患者肺組織標本免疫組化及雜交試驗顯示，HIF－2α mRNA染色弱陽性，蛋白質染色呈陰性，很少部分患者肺組織中肺泡上皮細胞及小部分肺動脈壁HIF－2α mRNA 染色陽性，蛋白質染色呈弱陽性（表1，圖1、3） 。

2.3 P-ERK、P-JNK、P-P38、P-Akt蛋白質的表達

COPD 患者肺部部分肺動脈壁細胞P-ERK蛋白質染色呈強陽性，其余部位P-ERK蛋白質染色均呈陽性（表2，圖6），對照組大部分肺組織P-ERK染色呈陰性，部分肺泡上皮細胞及少量肺動脈壁染色呈弱陽性（表2，圖5）。COPD 患者肺部標本組織免疫組化及雜交試驗顯示，部分肺動脈壁細胞P-Akt蛋白質染色呈強陽性，其余部位P-Akt蛋白質染色均呈陽性（表3，圖12），對照組患者肺標本免疫組化及雜交試驗染色顯示，大部分肺組織P-Akt染色呈陰性，少量肺泡上皮細胞及小部分肺動脈壁染色呈弱陽性（表3，圖11）。COPD 患者肺部組織免疫組化及雜交試驗染色顯示，部分肺動脈壁細胞P-JNK，P-P38蛋白質染色呈陰性，其余部位P-JNK、P-P38蛋白質染色均呈弱陽性（表2，圖8，10）。對照組患者肺部組織免疫組化及雜交試驗染色顯示大部分肺組織P-JNK、P-P38染色呈陰性（表2，圖7，9），少量肺泡上皮細胞及小部分肺動脈壁染色呈弱陽性。

表1 肺動脈HIF－1α基因表達水平比較

表2 肺動脈P-ERK，P-JNK，P-P38表達水平比較

表3 肺動脈P-PKB表達水平比較

注：表中數字為相應染色結果的血管數量

3 討論

COPD的發病機制尚未完全明了，目前普遍認為COPD以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞（尤其是CD）和中性粒細胞增加，部分患者有嗜酸性粒細胞增多。激活的炎癥細胞釋放多種介質，包括白三烯B4（LTB4）、白細胞介素8（1L-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和其他介質。這些介質能破壞肺的結構和（或）促進中性粒細胞炎癥反應。除炎癥外，肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡以及自主神經系統功能紊亂（如膽堿能神經受體分布異常）等也在COPD發病中起重要作用。

本文研究顯示對照組患者肺組織少量肺泡上皮細胞及很少的肺動脈壁HIF－2α mRNA陽性、HIF－2α，P-ERK，P-Akt蛋白質弱陽性，其余肺組織HIF－2α mRNA 弱陽性，HIF－2α、P-ERK、P-Akt蛋白質陰性；COPD 患者肺部HIF－2α mRNA 及蛋白質和P-ERK、P-Akt蛋白表達均明顯增強，由此可見HIF－2α基因的轉錄和翻譯以及P-ERK、P-Akt蛋白在COPD 患者肺組織內均明顯增強或上調，這提示HIF－2 和P-ERK、P-Akt參與了COPD 的發病過程。COPD 患者氣流受限，導致的低氧血癥，肺泡通氣不足氧分壓下降及反應性氣道狹窄肺泡通氣不均等因素可有效引發患者肺部HIF－2α蛋白質和P-ERK、P-Akt表達增強。

動物和細胞實驗證明[5-10]，在缺氧條件下，P-ERK和P-Akt活化表達，可使HIF-2α中氧依賴性降解區內氨基酸磷酸化，進而增加HIF-2α的穩定性，還可通過其磷酸化解除其翻譯調控蛋白EIF-4E的抑制因素，進一步增加HIF-2α的翻譯、轉錄，間接促進HIF-2α蛋白表達的增加。本組實驗發現，伴隨肺部P-ERK和P-Akt蛋白表達增加，對應部位的HIF-2α蛋白表達也明顯增加，并且COPD患者肺動脈管壁，P-Akt、P-ERK蛋白和HIF－2α表達均顯著增高，且同時顯微鏡觀察顯示COPD患者微動脈平滑肌增厚，肺動脈壁增厚、動脈管腔變窄，由此可以得出P-ERK，P-Akt通過增加HIF－2α基因的表達而間接參與了COPD患者的肺血管重構。

[參考文獻]

[1]李啟芳，戴愛國. 大鼠缺氧性肺動脈高壓時三種缺氧誘導因子α亞基在肺動脈中的差異表達[J]. 中華結核和呼吸雜志，2006，29（2）：113-117.

[2]李啟芳，戴愛國. 慢性阻塞性肺疾病患者肺小血管低氧誘導因子-α的表達[J]. 中華內科雜志，2006，45（2）：136-139.

[3]孔春初，戴愛國，胡瑞成. 磷酸肌醇3－激酶調控缺氧誘導因子1α對大鼠缺氧性肺動脈高壓的作用[J]. 中國病理生理雜志，2006，22（11）：2132-2137.

[4]孔春初，戴愛國. 絲裂原活化蛋白激酶調節缺氧誘導因子1α對大鼠缺氧性肺動脈高壓的作用[J]. 中華結核和呼吸雜志，2005，28（5）：328-332.

[5]Sally K. Martin， Peter Diamond， et al. Hypoxia-inducible factor-2 is a novel regulator of aberrant CXCL12 expression in multiple myeloma plasma cells[J]. Haematologica，2010，95（5）：776-784.

[6]Sascha Seidel，Boyan K. Garvalov et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2[J]. Brain，2010，133（pt 4）：983-995.

[7]Julie M. Roda，Laura A. Sumner et al. Hypoxia-Inducible Factor-2α Regulates GM-CSF-Derived Soluble Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Production from Macrophages and Inhibits Tumor Growth and Angiogenesis J[J]. Immunol Aug，2011，187（4）：1970-1976.

[8]Hye-Sik Kong，Sunmin Lee，Kristin Beebe，et al. Emetine Promotes von Hippel-Lindau-Independent Degradation of Hypoxia-Inducible Factor-2 in Clear Cell Renal Carcinoma[J]. Mol Pharmacol，2010，78（6）：1072-1078.

[9] Faten Bougatef，Cathy Quemener，Sabrina Kellouche，et al. EMMPRIN promotes angiogenesis through hypoxia-inducible factor-2-mediated regulation of soluble VEGF isoforms and their receptor VEGFR-2[J]. Blood， Dec，2009，114（27）：5547-5556.

[10]Samar Farha， Kewal Asosingh， Weiling Xu，et al. Hypoxia-inducible factors in human pulmonary arterial hypertension： a link to the intrinsic myeloid abnormalities[J].Blood，2011，117（13）：3485-3493.

（收稿日期：2012-05-15）