高濃度甲狀腺素對軟骨細胞聚集體（pellets）體外形成軟骨組織的作用

劉瑾春等

[摘要]目的：藥物濃度（100nM）甲狀腺素對組織工程軟骨形成的作用。方法：將軟骨細胞聚集體分為常規(guī)培養(yǎng)組（DMED+10%FBS）和100nM甲狀腺素組（DMED+10% FBS +100nM甲狀腺素），體外培養(yǎng)1、2和3周取材進行大體形態(tài)、組織學(xué)、二型膠原和十型膠原免疫組化染色和軟骨特異基因PCR分析。結(jié)果：100nM甲狀腺素組形成的軟骨細胞聚集體的體積和濕重均明顯低于常規(guī)培養(yǎng)組，甲苯胺蘭、二型膠原（ColⅡ）染色較常規(guī)培養(yǎng)組弱，軟骨細胞特異基因的表達水平與常規(guī)培養(yǎng)組相似，軟骨細胞肥大相關(guān)基因十型膠原（ColⅩ）及基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）的表達較對照組減弱，成骨方向分化相關(guān)基因（ColⅠ，Runx2）的表達與常規(guī)培養(yǎng)組相似。結(jié)論：高濃度甲狀腺素能夠抑制軟骨細胞肥大，但同時也抑制了軟骨細胞增殖和軟骨細胞基質(zhì)分泌。

[關(guān)鍵詞]甲狀腺素；軟骨組織工程；軟骨細胞；細胞外基質(zhì)；細胞聚集體

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼][文章編號]1008-6455（2012）08-1324-04

軟骨組織工程為軟骨缺損修復(fù)提供了一種新的治療方法[1]。軟骨細胞是軟骨組織工程種子細胞的一個重要來源，目前應(yīng)用軟骨細胞為種子細胞在體內(nèi)外已經(jīng)能夠成功構(gòu)建出精確形狀的成熟軟骨組織[2-3]。但是體外構(gòu)建的組織工程軟骨的生化和力學(xué)質(zhì)量與生理軟骨仍具有一定的差距[4]。在目前軟骨細胞常規(guī)培養(yǎng)方案（主要為DMEM添加10%胎牛血清）基礎(chǔ)上尋找新的優(yōu)化成分是軟骨組織工程的課題之一。

1材料和方法

1.3 軟骨細胞pellets培養(yǎng)：第二代軟骨細胞（P2）聚集體（pellets）根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為2組，常規(guī)組培養(yǎng)基：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素。100nM甲狀腺素組：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，100nM甲狀腺素。體外外培養(yǎng)1周，2周，3周分別取材進行大體、組織學(xué)及相關(guān)基因表達的檢測。

1.4 組織學(xué)檢測：取材后將標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切成5μm厚切片進行甲苯胺藍染色觀察細胞外基質(zhì)中糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）分泌情況。應(yīng)用鼠抗II型膠原單克隆抗體（Sigma）檢測II型膠原表達情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：計量指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準差的形式表示，所測數(shù)據(jù)采用t檢驗（Student's t-test）進行統(tǒng)計分析，P<0.05為具有顯著性差異，統(tǒng)計軟件包為SPSS Ver.16.0。

2結(jié)果

2.4 Col II和Col X免疫組化染色結(jié)果：兩組pellets在第3天以及第1，2，3周的縱切面Col II和Col X染色見圖4。第1周兩組開始明顯表達Col II，在培養(yǎng)3周時常規(guī)培養(yǎng)組Col II染色略強于100nM甲狀腺素組。兩組在培養(yǎng)第3天起即有Col X表達，在培養(yǎng)的3周過程中兩組的ColX染色相當(dāng)。

3討論

本實驗觀察了藥物濃度（100nM）甲狀腺素對于體外組織工程軟骨形成的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度的甲狀腺素能抑制軟骨細胞肥大以及成骨相關(guān)基因的表達，但同時使形成的軟骨樣組織減小，細胞外基質(zhì)糖胺多糖和二型膠原的表達減少。

甲狀腺素是機體內(nèi)調(diào)節(jié)生長板軟骨的生長和骨骼成熟的重要系統(tǒng)內(nèi)分泌因子，甲狀腺素直接刺激生長板軟骨細胞的生長和成熟[11]。研究顯示，甲狀腺素低下的小鼠會出現(xiàn)骨骺板內(nèi)軟骨細胞增殖層和肥大層細胞減少，導(dǎo)致骺板厚度的降低，補充T4可以逆轉(zhuǎn)這種生長板的紊亂，而補充生長激素則不能逆轉(zhuǎn)這種紊亂，提示甲狀腺素對軟骨細胞增殖和成熟的作用[12]。在體外研究中也發(fā)現(xiàn)，低于或者近于生理濃度的甲狀腺素（0.1～1.0nM）能夠促進生長板軟骨細胞轉(zhuǎn)化為肥大軟骨細胞，肥大標(biāo)志基因堿性磷酸酶（ALP）的表達增加了130%[8]。甲狀腺素對于軟骨細胞形成典型的柱狀排列的形態(tài)也有重要作用[13]。因此甲狀腺素被認為是能夠誘導(dǎo)軟骨細胞成熟為肥大細胞的激素之一[14-15]。

研究顯示，生理濃度甲狀腺素對軟骨細胞的克隆形成和增殖具有明顯的抑制作用[16]，這一結(jié)果與本實驗的MTT結(jié)果相似。本實驗中，1nM甲狀腺素組和100nM甲狀腺素組的MTT值無統(tǒng)計學(xué)差異，說明甲狀腺素對軟骨細胞增殖的作用并無明顯劑量依賴關(guān)系。生理濃度甲狀腺素能夠抑制小鼠軟骨細胞pellets的Sox9基因的表達，并且促進軟骨細胞肥大分化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度的甲狀腺素抑制Sox9的作用仍舊存在，提示高濃度的甲狀腺素引起軟骨細胞改變的途徑與與生理濃度下甲狀腺素通過核受體引起軟骨細胞相應(yīng)改變的途徑相同；但是與生理濃度不同的是，高濃度的甲狀腺素反而抑制了軟骨細胞的肥大分化，這一點與Guangyao Liu等[8]的研究結(jié)果相似：高于100nM的T3可以明顯地抑制軟骨細胞體外培養(yǎng)時的去分化和肥大分化，軟骨肥大相關(guān)基因（ColX，MMP13）的表達均低于常規(guī)培養(yǎng)組。但是在Guangyao Liu等[8]的研究中，甲狀腺素與胰島素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2聯(lián)合應(yīng)用取得了較好的培養(yǎng)效果，而本實驗單獨應(yīng)用了高濃度的甲狀腺素并且發(fā)現(xiàn)抑制了軟骨特異細胞外基質(zhì)基因和蛋白的表達，因此推測高濃度甲狀腺素是通過與胰島素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的信號通路相互作用而發(fā)揮藥物作用的，聯(lián)合應(yīng)用后可能會有較好的效果。

本文探討了高濃度甲狀腺素對組織工程軟骨形成的影響，顯示高濃度甲狀腺素能夠抑制軟骨細胞肥大及成骨分化，但同時也抑制了軟骨細胞的增殖和分泌基質(zhì)，從而為甲狀腺素在軟骨組織工程中的應(yīng)用提供了參考。

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[收稿日期]2012-03-29[修回日期]2012-06-21

編輯/張惠娟