創愈生肌散對糖尿病大鼠模型慢性創面的治療作用研究

張子茜等

[摘要]目的：觀察以中藥傳統方劑生肌散為基礎的改良新藥創愈生肌散對糖尿病大鼠模型慢性難愈創面的治療作用。方法：對糖尿病大鼠模型慢性難愈創面經隨機分組后給予外用創愈生肌散和rb-bFGF，以未作處理的創面作為空白對照。分別在傷后第1、4、7、10、14和21天觀察各組慢性難愈創面的愈合情況，使用Real time PCR方法檢測各時間點慢性難愈創面中VEGF、HIF-1α以及Ang1基因的表達情況。結果：在糖尿病性慢性難愈創面模型中，創愈生肌散組糖尿病性慢性難愈創面的愈合時間為（21.3±2.1）天，rb-bFGF組創面的愈合時間為（23.2±2.4）天，對照組創面的愈合時間為（26.8±2.8）天，差別有統計學意義（P<0.05）。使用Real time PCR方法檢測發現，創愈生肌散組的創面標本中的VEGF、HIF-1α以及Ang1表達量明顯高于其他兩組，差別有統計學意義（P<0.05）。結論：使用創愈生肌散可明顯縮短糖尿病性慢性難愈創面的愈合時間，創愈生肌散可通過上調VEGF、HIF-1α以及Ang1等與新生血管密切相關的基因表達而促進創面中的血管生成。

[關鍵詞]創愈生肌散；大鼠；糖尿病；慢性難愈創面

[中圖分類號]R622R332[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）08-1334-03

創面是正常皮膚組織在外界致傷因素及機體內在因素如營養不良、缺氧和感染等作用所導致的損害，表現為破壞皮膚完整性及丟失正常組織形態及功能。通常將4～6周不愈合的創面稱為慢性難愈創面，大多需要長時間的治療，每年創面處理的醫療費非常高。伴隨我國人民生活水平提高和人口逐步老齡化，糖尿病的發病率逐年上升，伴隨而來的糖尿病性慢性創面的發生率越來越高，除了影響患者生活質量，治療不及時的慢性創面經常致殘、致畸[1-2]。大量實驗已證明慢性難愈創面愈合的核心問題之一是局部血運不良，創面愈合血管化延遲，因此，尋找促進創面愈合的血管化的新藥十分必要[3]。目前臨床上使用各類生長因子，但是臨床試用效果并不理想，且存在價格昂貴、半衰期短、基因治療的不成熟性等問題。然而，千百年來，祖國醫學的中藥外用對創面愈合卻具有獨特療效。因此，充分發揮外用中藥有效促進創面愈合的特長，系統研究藥物作用機理具有重要的意義。

創愈生肌散是由第四軍醫大學西京醫院根據中藥傳統方劑生肌散改良而來的新型中成藥制劑，該藥物在藥理上具有止血、消腫、消炎、促進傷口愈合，治療各種燒燙傷、外傷有效的方法功效，在對犬的大、中、小型切口模型中，創愈生肌散能明顯縮短創面愈合時間，降低創面感染率，促進愈合[4-5]。

為了研究創愈生肌散對慢性難愈創面的治療功效和相關機制，本實驗通過構建糖尿病慢性難愈創面動物模型，與rb-bFGF和空白對照相比，觀察使用創愈生肌散后慢性難愈創面動物模型的創面愈合情況。并且采用分子生物學的方法，檢測血管形成及相關分子的表達，深入探討創愈生肌散促進慢性難愈性創面愈合血管化的分子機制。

1材料和方法

1.1 實驗動物及試劑：本實驗使用SD大鼠均為雄性，8～10周齡，150～200g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。Real time PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產品；VEGF單抗、HIF-1α單抗和Ang-1單抗為武漢博士德公司產品；rb-bFGF為珠海億勝生物制藥有限公司產品。

1.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的構建： 54只SD大鼠均喂以高糖高脂飼料，配方為基礎飼料66.5%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鹽1%、奶粉4%、雞蛋1.5%；饑餓12h（過夜禁食，不禁水）后，按照40mg/kg體重的比例，從尾靜脈注射pH4.5、0.1mol/L檸檬酸緩沖液配制的1%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）；實驗過程中檢測各組隨機血糖及空腹血糖、葡萄糖耐量；于造模第4周和第8周對所有的大鼠行葡萄糖耐量實驗；糖尿病大鼠模型建成標準為：大鼠禁食12 后以50%葡萄糖溶液灌胃后血糖峰值16.7mol/L、120min血糖達到11.1mmol/L、且體重明顯下降（>50g）。

1.3 慢性難愈性創面的構建：將確認建模成功的SD大鼠使用鹽酸戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射麻醉；腰椎正中偏上剪毛并在造模區標記相同的2cm×2cm的造模面積；在無菌條件下，沿脊椎方向用外科方法作切取全等皮膚，建立全層皮膚缺損開放性創面模型；創面加蓋兩層消毒干紗布，醫用膠布固定，造模后每只大鼠連續3天后肢肌肉注射青霉素40萬U預防感染。

1.4 實驗分組及藥物使用：SD大鼠54只，按照體重隨機分為3組：創愈生肌散組、rb-bFGF組以及空白對照組各18只；創愈生肌散組SD大鼠每日創面消毒后，生理鹽水沖洗創面，創愈生肌散（第四軍醫大學西京醫院藥劑科，蘭制字2006F68129）1g直接敷于創面，每日兩次； rb-bFGF組SD大鼠創面每日消毒后，生理鹽水沖洗后，按150AU/cm2劑量將藥物直接噴于創面，表面紗布包扎固定，每日兩次；對照組：創面清創消毒后，每日換藥兩次，不給于任何藥物；分別于術后1、4、7、10、14、21天觀察記錄各組大鼠的創面愈合情況，計算局部創面愈合率，并處死大鼠，并以每個創面為中心，切取2.2cm×2.2cm大小組織（含全部創面）用于實時PCR檢測。

1.6 Real time PCR檢測：按照TaKaRa公司Real time PCR檢測試劑盒操作說明進行，在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上進行反應，所有實驗重復三次。

1.7 統計學方法：采用統計學軟件SPSS 13.0，以方差分析檢驗各組均數問的差異，如果差異有統計學意義，S-N-K檢驗進一步行多重比較。

2結果

3討論

本研究利用鏈脲左菌素實驗性糖尿病動物模型用于模仿糖尿病慢性難愈創面，雖然轉基因型和自發型糖尿病模型已應用于研究領域，但是來源較少，飼養條件高、價格昂貴，難于大規模的廣泛普及應用。目前鏈脲左菌素實驗性糖尿病動物模型是應用最為廣泛的實驗性糖尿病動物模型，具有技術成熟、成功率高和成本低等優點。利用該模型構建糖尿病性慢性難愈創面，并分別給予創愈生肌散和rb-bFGF，觀察兩種藥物對創面愈合的影響。并且使用分子生物學方法檢測創面標本中VEGF、HIF-1α和Ang1的表達以及微血管密度。

經過觀察，創愈生肌散組糖尿病性慢性難愈創面的愈合時間與rb-bFGF組和對照組相比明顯縮短，差別有統計學意義（P﹤0.05）。通過計算創面愈合率發現，創愈生肌散組的糖尿病性慢性難愈創面的愈合率明顯高于其他兩組，說明使用創愈生肌散可明顯促進糖尿病性慢性難愈創面的愈合。Real time PCR和免疫組織化學染色結果發現，糖尿病性慢性難愈創面給藥后第1天、4天、7天和10天，創愈生肌散組難愈創面標本中的VEGF、HIF-1α和Ang1的表達明顯高于rb-bFGF組和對照組，而第14天和21天三組之間則無明顯差異。說明創愈生肌散有明顯的上調VEGF、HIF-1α和Ang1表達的作用。以上結果說明創愈生肌散可通過上調與新生血管關系密切的基因表達如VEGF、HIF-1α和Ang1促進糖尿病性慢性難愈創面中的血管發生，進而加速糖尿病性慢性難愈創面的愈合。本研究結果將為臨床廣泛應用生肌類中藥提供理論依據，也能夠為今后研究中西醫結合的治療方法提供方向，并將會促進祖國傳統中醫藥在國際上的競爭力。

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[收稿日期]2012-04-11[修回日期]2012-06-28

編輯/張惠娟