人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)評(píng)價(jià)化妝品安全性

仲少敏等

[摘要]目的：介紹人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)（HRIPT， Human Repeated Insult Patch Test）在化妝品安全性評(píng)估中的作用，并用該方法對(duì)11種化妝品的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：在53名志愿者中對(duì)11種化妝品進(jìn)行人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)，誘導(dǎo)期在后背部同一部位重復(fù)9次斑貼試驗(yàn)；之后休息2周，在非斑貼部位皮膚進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)，斑貼24h、48h和72h后進(jìn)行評(píng)分。試驗(yàn)結(jié)果判讀參考國(guó)際接觸性皮炎研究組ICDRG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)化妝品的性質(zhì)分別選擇封閉或半封閉斑試器，0.3%～0.5%SLS作為陽性對(duì)照，凡士林和空白斑試器作為陰性對(duì)照。結(jié)果：11種受試化妝品中有7種顯示出輕度的刺激性，1名受試者在試驗(yàn)前已對(duì)其中1種化妝品呈致敏狀態(tài)，11種測(cè)試產(chǎn)品均未出現(xiàn)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)。結(jié)論：人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)敏感性高，能夠明確區(qū)分刺激性、已致敏性和潛在致敏性，可以作為化妝品安全性的確證試驗(yàn)。

[關(guān)鍵詞]人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)；皮膚刺激測(cè)試；接觸過敏；化妝品安全性

[中圖分類號(hào)]R758.22[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）08-1342-04

隨著美容護(hù)膚品市場(chǎng)的不斷發(fā)展，新的化妝品和美容護(hù)膚手段層出不窮，化妝品不良反應(yīng)及化妝品皮膚病的發(fā)生幾率也逐年增加。國(guó)家成立了專門的監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)和診斷機(jī)構(gòu)對(duì)化妝品不良反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并同時(shí)加強(qiáng)對(duì)新研發(fā)化妝品上市前安全性的評(píng)估。對(duì)一種化妝品的安全性評(píng)估主要評(píng)價(jià)其是否具有使皮膚致敏和引起過敏性接觸性皮炎的可能性。目前評(píng)價(jià)的方法包括對(duì)產(chǎn)品組分結(jié)構(gòu)特性的分析、文獻(xiàn)回顧、動(dòng)物局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA）和人體試驗(yàn)等。其中，人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）被認(rèn)為是證明產(chǎn)品不會(huì)在人體產(chǎn)生不良反應(yīng)的最可信方法[1]，用于對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)判定為無明顯不良反應(yīng)水平（NOEL）的物質(zhì)的確證試驗(yàn)[2]。目前國(guó)內(nèi)很少有報(bào)道采用HRIPT進(jìn)行化妝品安全性評(píng)估。本文介紹了筆者科室近期進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)常見刺激物及11種受試產(chǎn)品的HRIPT試驗(yàn)，對(duì)如何進(jìn)行HRIPT試驗(yàn)和結(jié)果判讀進(jìn)行闡述。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象：53名健康自愿受試者，其中男性6名，女性47名。受試者年齡為23～53歲（平均為34.7歲）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于懷孕期、哺乳期或分娩半年內(nèi)；②患有可能干擾試驗(yàn)結(jié)果或增加受試者研究參加風(fēng)險(xiǎn)的急性或慢性疾病；③正在口服或外用可能干擾試驗(yàn)結(jié)果的藥物（如糖皮質(zhì)激素、非甾體類消炎藥、抗組胺類藥物和免疫抑制劑等）；④患有慢性過敏性皮膚病或近12個(gè)月內(nèi)被診斷為皮膚腫瘤并接受治療者；⑤在斑貼部位有日曬傷、皮膚顏色不均勻、文身、痤瘡、濕疹、牛皮癬、瘢痕及其他可能會(huì)影響觀察的皮膚病受試者；⑥試驗(yàn)經(jīng)過北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2試驗(yàn)材料

1.2.2斑試器：封閉式斑試器：為貼附于封閉式膠帶上的8mm鋁制小碟（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)儀器公司）；半封閉斑試器：為直徑23mm的圓形防過敏膠帶（Curad Sensitive Skin ， Beiersdorf Inc.， Wilton CT）。

1.3試驗(yàn)流程[3]： 整個(gè)試驗(yàn)過程分為誘導(dǎo)期（3周），休息期（2周）和激發(fā)期（1周）三部分，持續(xù)時(shí)間為6周。試驗(yàn)過程如圖1所示。

1.3.1誘導(dǎo)期：將加有受試物的斑試器用無刺激膠帶貼敷于受試者的脊柱右側(cè)，用手掌輕壓以使之均勻地貼敷于皮膚上，并用標(biāo)記筆標(biāo)記斑貼部位，保證誘導(dǎo)階段9次每個(gè)產(chǎn)品都是貼在相同的部位（每周一、三、五進(jìn)行），如圖2所示。持續(xù)24h后，囑受試者將斑試器取下，避免搓洗局部。再間隔24h后（即下次斑貼之前，周五斑貼的為間隔48h）觀察反應(yīng)。以上步驟共重復(fù)9次，持續(xù)時(shí)間為3周。

1.3.2 休息期：在誘導(dǎo)期結(jié)束后休息10～14天，期間無任何處理。

2結(jié)果

2.1結(jié)果判讀：HRIPT的結(jié)果是根據(jù)受試者在誘導(dǎo)期和激發(fā)期的皮膚反應(yīng)綜合判定的。如受試者在某個(gè)樣品點(diǎn)上誘導(dǎo)期早期即發(fā)生紅斑、水腫、丘疹等反應(yīng)，并在激發(fā)期再次出現(xiàn)同樣等級(jí)的反應(yīng)，表明該受試者在試驗(yàn)前已被該樣品致敏，記為前致敏狀態(tài)（Pre-sensitization）。如果在誘導(dǎo)期出現(xiàn)輕度反應(yīng)（1～2分），而激發(fā)期未再現(xiàn)，為該樣品重復(fù)刺激造成的刺激反應(yīng)（Irritation）；如果受試者在激發(fā)期的反應(yīng)較誘導(dǎo)期明顯增強(qiáng)，表示該樣品在試驗(yàn)期間誘導(dǎo)出這位受試者的過敏反應(yīng)，提示這種產(chǎn)品具有潛在致敏性，記為誘導(dǎo)過敏（Induction of Sensitization） [5]。

Henderson 和Riley 對(duì)HRIPT的結(jié)果進(jìn)行過統(tǒng)計(jì)學(xué)推算，假設(shè)在樣本量為100的人群中進(jìn)行HRIPT檢測(cè)，如果結(jié)果為陰性，那么在同樣情況下使用這些產(chǎn)品時(shí)，在人群中產(chǎn)生過敏反應(yīng)的幾率最大不會(huì)超過2.9%[2]。需要注意的是，因?yàn)镠RIPT是在增加濃度和封閉的情況下測(cè)試，實(shí)際使用時(shí)過敏率更低，根據(jù)Hall等[6]的估計(jì)，化妝品誘導(dǎo)出皮膚過敏的概率約為0.09%。因此，HRIPT的陰性結(jié)果可以作為確證實(shí)驗(yàn)來證實(shí)化妝品的安全性。

3討論

人重復(fù)性損傷性斑貼試驗(yàn)（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）自1944年被Schwartz和Peck提出以后，經(jīng)過不斷的改良，目前已經(jīng)被認(rèn)為是評(píng)價(jià)新材料或消費(fèi)品對(duì)人體致敏性和刺激性的最可信方法。HRIPT在歐美的使用率是最高的，經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織（OECD）和EU試驗(yàn)指南中這兩種試驗(yàn)也是優(yōu)選的方法，并可以在其他方法獲得數(shù)據(jù)不足的時(shí)候作為確證試驗(yàn)[2]。HRIPT具有封閉性，可以模擬并放大人體實(shí)際使用過程，現(xiàn)已證實(shí)封閉式試驗(yàn)優(yōu)于皮內(nèi)注射和開放式局部應(yīng)用的方法，具有足夠的敏感性，能檢測(cè)出絕大部分的致敏物[7-8]。

HRIPT在誘導(dǎo)期，每次斑貼持續(xù)24h，然后間隔24h或48h讀結(jié)果，并進(jìn)行下一次斑貼，可以使前一次斑貼造成的皮膚反應(yīng)充分顯現(xiàn)。誘導(dǎo)期結(jié)束后2周的休息期則使得各種免疫反應(yīng)可以充分進(jìn)行，并且此時(shí)誘導(dǎo)期的過敏反應(yīng)通常都已消失，不會(huì)對(duì)激發(fā)期產(chǎn)生干擾。所用檢測(cè)物的濃度設(shè)定通常建議采用不引起刺激的最高濃度，這個(gè)濃度是從之前人體刺激性試驗(yàn)、過敏原測(cè)試和人體重復(fù)應(yīng)用試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)中獲得，有時(shí)還需要結(jié)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮，如對(duì)實(shí)際應(yīng)用中濃度放大數(shù)倍或者參照誤用后濃度進(jìn)行檢測(cè)。通過采取劑量依賴性研究甚至可以了解通過減少劑量是否能達(dá)到安全的使用量，即反應(yīng)誘發(fā)閾值（response elicitation threshold）[9]。這些特點(diǎn)都使得HRIPT具有更高的敏感性。在本研究中，11種產(chǎn)品在激發(fā)期都沒有出現(xiàn)陽性反應(yīng)，但在誘導(dǎo)期有1～9人對(duì)5種樣品1、4、5、7、12、13和14中出現(xiàn)輕度紅斑反應(yīng)，提示在實(shí)際使用過程中，重復(fù)外用這幾種化妝品可能具有一定的刺激性。但這個(gè)結(jié)果只有通過HRIPT才能夠發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的斑貼試驗(yàn)是單次試驗(yàn)結(jié)果判讀，就會(huì)得到類似誘導(dǎo)期的陰性結(jié)果。再次證明HRIPT的敏感性和在化妝品安全性檢測(cè)中的重要意義。

斑貼試驗(yàn)的結(jié)果受到諸多因素的影響，如稀釋受試樣品的基質(zhì)、樣品濃度、所用樣品的量、封閉方式等都可能影響，產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果[10-11]。通常情況下，對(duì)于乳液、爽膚水等可在皮膚上長(zhǎng)期駐留的產(chǎn)品可以選擇用未經(jīng)稀釋的原液進(jìn)行斑貼。而對(duì)于潔面乳這種洗脫類產(chǎn)品，由于在實(shí)際使用中會(huì)被大量的水沖洗掉，選擇用蒸餾水進(jìn)行稀釋，用1%的稀釋液進(jìn)行斑貼。即使這一濃度也大于實(shí)際使用中人體對(duì)這種化妝品的暴露濃度[12]。此外，封閉式斑試器也起到對(duì)受試樣品暴露的放大作用。而對(duì)于卸妝乳，其油溶性成分含量較高，通過以油溶油的原理去除彩妝，本身性質(zhì)比較溫和，某些按摩油本身也具有卸妝的作用，可以在面部長(zhǎng)期駐留。因此需要根據(jù)產(chǎn)品本身的性質(zhì)判斷濃度和斑貼方式。本研究中有3種卸妝乳，考慮到放大效應(yīng)，對(duì)3、5號(hào)選擇了封閉式斑貼，11號(hào)因?yàn)楹休^多量表面活性劑，與12～14號(hào)潔面乳一樣選擇了半封閉斑試器進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果只有5號(hào)有輕度的刺激反應(yīng)，無過敏反應(yīng)出現(xiàn)，說明在實(shí)際應(yīng)用中是很安全的。

在進(jìn)行多樣品斑貼試驗(yàn)時(shí)還需要注意激動(dòng)皮膚綜合征（excited skin syndrome）， 是由于皮膚對(duì)于某個(gè)樣品包括對(duì)于斑貼所用的膠帶等產(chǎn)生的強(qiáng)烈反應(yīng)，可能會(huì)誘導(dǎo)出高激惹狀態(tài)（俗稱“激惹的后背”），從而使得其他樣品也出現(xiàn)輕度的陽性反應(yīng)[13]。在本研究中，我們觀察到一些受試者對(duì)試驗(yàn)用的膠帶或陽性對(duì)照產(chǎn)生比較強(qiáng)烈的反應(yīng)，同時(shí)多個(gè)其他樣品點(diǎn)也表現(xiàn)為輕度紅斑反應(yīng)，可能也受到了激動(dòng)皮膚綜合征的影響，對(duì)于膠帶或陽性對(duì)照的強(qiáng)陽性反應(yīng)也可能增加了樣品刺激反應(yīng)率。

總之，HRIPT 通過采用延長(zhǎng)暴露時(shí)間，采用較高使用濃度和封閉斑貼的方法，達(dá)到一種比實(shí)際使用時(shí)的放大效果，并可以檢測(cè)出極微弱的刺激反應(yīng)，提示在實(shí)際使用時(shí)可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。HRIPT的陰性結(jié)果可以證明人體不會(huì)對(duì)特定產(chǎn)品或配方產(chǎn)生不良反應(yīng)。盡管如此，需要注意的是：出于倫理方面的考慮，HRIPT試驗(yàn)并不用于預(yù)測(cè)或者篩選鑒定潛在的致敏原，而主要作為確證試驗(yàn)，在放大應(yīng)用的條件下來檢測(cè)配方中的過敏原，保證產(chǎn)品在面對(duì)消費(fèi)者應(yīng)用時(shí)的安全性[1-2]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]McNamee PM，Api AM，Basketter DA，et al. A review of critical factors in the conduct and interpretation of the human repeat insult patch test [J].Regul Toxicol Pharmacol，2008，52（1）：24-34.

[2]Van Loveren H，Cockshott A，Gebel T，et al.Skin sensitization in chemical risk assessment： report of a WHO/IPCS international workshop focusing on dose-response assessment[J]. Regul Toxicol Pharmacol，2008，50（2）：155-199.

[3]Fischer T，Maibach HI.Finn chamber patch test technique [J].Contact Dermatitis，1984，11（3）：137-140.

[4]Rycroft RJG，Menné T，F(xiàn)rosch PJ.Textbook of Contact Dermatitis [M].2nd edition.Berlin：Springer-Verlag， 1995：438-468.

[5]Politano VT，Api AM.The Research Institute for Fragrance Materials' human repeated repeated insult patch test protocol [J].Regul Toxicol Pharmacol，2008，52（1）：35-38.

[6]Hall B.Prevention of contact allergy to cosmetics safety of consumer confirmed by the human repeat insult patch test （HRIPT）. 8th Congress of the European Society of Contact Dermatitis[J].Contact Dermatitis，2006，55 Suppl 1： 3-60.

[7]Basketter DA.Skin sensitization： risk assessment [J].Int J Cosmet Sci，1998，20（3）：141-150.

[8]Basketter DA，Jefferies D，Safford BJ，et al.The impact of exposure variables on the induction of skin sensitization [J].Contact Dermatitis，2006，55（3）：178-185.

[9]Basketter DA，Clapp CJ，Safford BJ，et al.Preservatives and skin sensitization quantitative risk assessment[J].Dermatitis，2008，19（1）：20-27.

[10]Basketter DA.Skin sensitization： strategies for the assessment and management of risk [J].Br J Dermatol， 2008，159（2）：267-273.

[11]Menne T，Wahlberg JE.Risk assessment failures of chemicals commonly used in consumer products [J]. Contact Dermatitis，2002，46（4）：189-190.

[12]Kimber I，Basketter DA，Berthold K，et al.Skin sensitization testing in potency and risk assessment [J]. Toxicol Sci，2001，59（2）：198-208.

[13]Bruynzeel DP，Maibach HI.Exited skin syndrome （angry back） [J].Arch Dermatol，1986，122（3）：323-328.

[收稿日期]2012-04-09[修回日期]2012-06-12

編輯/李陽利