沙棘種子油中脂肪酸組成的微量分析

謝佳琦 李賀

摘要：以３個沙棘品種（亞歷山大１２號、實優１號和丘伊斯克×中國無刺雄）的果實為材料，通過氣－質聯用法建立了沙棘種子油中脂肪酸組成的微量分析技術。脂肪酸用標準品結合質譜進行定性確證分析，脂肪酸組成用峰面積歸一法計算。結果表明，沙棘種子油中富含不飽和脂肪酸（７１．２％～７６．０％），其中亞油酸（C１８∶２ｎ－６）含量最高（３５．６％～３９．０％），α－亞麻酸（C１８∶３ｎ－３）含量次之（２７．８％～３３．４％）。

關鍵詞：沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）；種子油；脂肪酸； 微量分析

中圖分類號：Ｑ９４６．４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3319-04

Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓｅｅｄ Ｏｉｌ ｉｎ Ｓｅａ Ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ （Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）

ＸＩＥ Ｊｉａ－ｑｉ，ＬＩ Ｈｅ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｄａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６６００， Ｎｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ） ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ３ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｏｆ ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ， including Ｙａｌｉｓｈａnｄａ－１２， Ｓｈｉｙｏｕ－１ ａｎｄ Ｑｉｕｙｉｓｉｋｅ×Ｃｈｉｎｅｓｅ－Ｗｕｃｉｘｉｏｎｇ． Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｗｅｒｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ｏｉｌ ｂｙ ＭＳ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｅａｋ ａｒｅａ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｃｉｄｓ（７１．２％～７６．０％） ｗｅｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ｓｅｅｄ ｏｉｌ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ３５．６％ ａｎｄ ３９．０％， α－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｓｅｃｏｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ２７．８％ ａｎｄ ３３．４％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ （Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）； ｓｅｅｄ ｏｉｌ； ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ； ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ

沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）又名醋柳，胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或小喬木，廣泛分布于歐亞兩洲的溫帶地區，有６個種，１２個亞種。中國是沙棘資源大國，種植面積已達２００萬ｈｍ２，約占世界總面積的９０％以上，其中西北、華北、西藏、四川等林區都有豐富的沙棘天然資源［１，２］。沙棘具有極強的生態適應性，耐寒、耐旱、耐鹽堿，固氮和繁殖能力強，廣泛應用于土壤改良和水土保持。另外，沙棘的經濟價值較高，其果實富含維生素Ｃ、Ｄ、Ｅ，類胡蘿卜素、黃酮、不飽和脂肪酸等大量生物活性物質，可作為飲料、食品、化妝品和醫藥的原料［３－７］。

近幾十年，國際上開發利用沙棘的研究工作由食品逐漸轉入藥品領域，如用于生產藥用沙棘油等。沙棘油中富含不飽和脂肪酸，其中果油中的油酸含量最高，其次是棕櫚油酸，而種子油中含有豐富的亞油酸和亞麻酸［８－１０］。沙棘種子油作為藥用原料，廣泛用于治療燒傷、燙傷和凍傷等，對扁桃體炎、口腔炎和結膜炎等都有顯著療效，另外它還能調節免疫系統，對于心、腦血管系統疾病以及腫瘤、癌癥等有預防作用［１１］。

我國從20世紀８０年代中期開始，從俄羅斯、芬蘭等地引入多個沙棘優良品種，結合國內的種質資源進行良種選育，目前已選育出沙棘的新品種［１２－１４］。在沙棘種質資源評價的過程中，沙棘油成分是品質評價的重要指標，采用傳統的方法，如索氏提取［１５］、超臨界ＣＯ２萃取［１６，１７］等，需要采集大量樣品，耗時費力，分析成本高。本試驗建立了一種微量提取沙棘種子油并分析其脂肪酸組成的方法，該方法不僅可準確分析毫克級材料的脂肪酸組成，而且節省了分析成本，具有較好的應用價值。

１材料與方法

１．１材料與試劑

沙棘材料：亞歷山大１２號（ｓｓｐ． ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）、實優１號（ｓｓｐ． ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）和丘伊斯克×中國無刺雄的果實均采自大連民族學院試驗地，－５０ ℃保存。

３７種脂肪酸甲酯混合物標準品（４７８８５－Ｕ）和１．２５ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸－甲醇溶液購于Ｓｉｇｍａ公司。

正己烷、氯仿和甲醇均為色譜純試劑，購于Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂ＆Ｊ公司；氯化鉀為國產分析純試劑。

１．２儀器

ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｐｌｕｓ氣質聯用儀（島津，日本），真空冷凍干燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，美國）。

１．３方法

１．３．１沙棘種子油的微量提取取５粒冷凍保存的果實（－５０ ℃）于１０ ｍＬ離心管，管口貼上封口膜（封口膜上用針扎適量小孔），打開Ｌａｂｃｏｎｃｏ真空冷凍干燥機，降溫至－５０ ℃，放入該離心管，真空凍干４ d（０．１１ ｍＢａｒ，－５３ ℃）。凍干后，剝離果肉，取出種子（約０．３～０．５ ｇ），于研缽中輕搗，倒入液氮快速研磨至粉末狀。稱取約１００ ｍｇ左右樣品粉末于２ ｍＬ離心管中，分別加入１ ｍＬ氯仿－甲醇溶液（體積比為２∶１）和２５０ μＬ酸洗玻璃珠（０．５ ｍｍ），高速振蕩５ ｍｉｎ，然后放入液氮速凍５ ｍｉｎ，再于４℃下放置２ ｈ，裂解細胞，將細胞裂解液于４℃以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，收集上清，加入３００ μＬ １％ ＫＣｌ，混勻，瞬時離心１ ｍｉｎ，收集氯仿層于另一離心管中，并用５００ μＬ氯仿重新提取原來的離心管，合并氯仿層，在快速真空器中揮發至干。

１．３．２樣品甲酯化在上述的樣品中加２００ μＬ正己烷和５００ μＬ鹽酸－甲醇（１．２５ ｍｏｌ／Ｌ）溶液，混勻，依次在６０℃溫浴２ ｈ，－２０℃中冷凍２０ ｍｉｎ后，加入２５０ μＬ １％ ＫＣｌ溶液（ｍ／V），混勻，分層后，收集正己烷層，揮發溶劑，于－２０℃保存。分析前向樣品中加入５００ μＬ正己烷，０．４５ μｍ濾膜過濾后進行色譜分析。

１．３．３氣相色譜條件Ｒｔｘ－５ＭＳ毛細管柱（３０ ｍ×０．２５ ｍｍ×０．２５ μｍ），柱溫１２０ ℃，氣化室溫度２３０ ℃，載氣（Ｈｅ）壓力９８．１ kｐａ，氣流速度１．２０ ｍＬ／ｍｉｎ，進樣量１ μＬ，分流比２０∶１。柱箱升溫程序：升溫至１２０ ℃，保持２ ｍｉｎ，再以３ ℃／ ｍｉｎ升溫至２３０ ℃，保持２０ ｍｉｎ。

１．３．４質譜條件離子源（ＥＩ）溫度２００ ℃，接口溫度２３０ ℃，檢測器電壓０．７４ ｋＶ，溶劑切除時間１．８ ｍｉｎ，質量掃描范圍４０～６００ ａｍｕ。

２結果與分析

２．１微量提取的出油率

如表１所示，采用微量提取法獲得的５粒沙棘果實的出油率均在２０％以上，其中實優１號的種子出油率達到３７．８％，與索氏提取法、超臨界ＣＯ２萃取等方法相比，該法大大提高了種子的出油率。在凍干的果實中，丘伊斯克×中國無刺雄種子含量最高，但種子含油量相對較低；亞歷山大１２號和實優１號種子含量相對較低，但種子出油率較高，說明這2個沙棘品種的種子含油量較高，是提取沙棘油的理想原料。從果實總體干重來看，種子油含量差距不大，約在５．０％左右。

２．２種子油脂肪酸組成分析

經優化的３７種標準脂肪酸甲酯總離子流圖見圖１。由圖1可知，該色譜條件可分離標準脂肪酸甲酯。由圖2可知，樣本種子油中主要含有１２種脂肪酸，分別是十四烷酸（Ｃ１４∶０）、十五烷酸（Ｃ１５∶０）、棕櫚酸（Ｃ１６∶０）、棕櫚油酸（Ｃ１６：１）、十七烷酸（Ｃ１７∶０）、硬脂酸（Ｃ１８∶０）、油酸（Ｃ１８∶１ｎ－９）、亞油酸（Ｃ１８∶２ｎ－６）、α－亞麻酸（Ｃ１８∶３ｎ－３）、花生酸（Ｃ２０∶０）、反－１１－二十烯酸（Ｃ２０∶１）和二十二烷酸（Ｃ２２∶０）。圖３-圖５是３個品種沙棘種子油的脂肪酸總離子流色譜圖，從樣品色譜圖看，該方法的甲酯化效果較好，樣品中的脂肪酸均得到了較好的分離。

通過峰面積歸一法計算并分析沙棘種子油中的主要脂肪酸相對含量（表２）。由表2可知，３個沙棘品種種子油的不飽和脂肪酸含量均高于７０％，其中以亞油酸（Ｃ１８：２ｎ-６）和α－亞麻酸（Ｃ１８：３ｎ-３）為主，其次是油酸（Ｃ１８：１ｎ-９）。亞歷山大１２號、實優１號和丘依克斯×中國無刺雄的種子油中，亞油酸相對含量在３５．６%～３９．０％之間，平均為３７．１％，其中亞歷山大１２號最高；α－亞麻酸的相對含量在２７．８%～３３．４％之間，平均為３０．３％，其中實優１號最高。由此可見，亞油酸和α－亞麻酸是沙棘種子油中最主要的不飽和脂肪酸，這也是開發利用沙棘種子油的重要依據。

３討論

沙棘果肉和種子中的油脂含量很高，油脂含量是其主要的品質指標。由于基因型、海拔、氣候和成熟期等因素的影響，不同品種沙棘果實和種子的含油量有很大差異。一般來說，沙棘種子油含量變化在６%～２０％（m／m）之間［１８－２０］，種子油中占優勢的是Ｃ１８不飽和脂肪酸，包括油酸（Ｃ１８∶１）、亞油酸（Ｃ１８∶２）和亞麻酸（Ｃ１８∶３），其中亞油酸（Ｃ１８∶２ｎ－６）和α－亞麻酸（C１８∶３ｎ－３）特別豐富［２１，２２］。

對于沙棘種子油的提取方法而言，目前主要包括索氏提取法、超臨界ＣＯ２萃取、氯仿－甲醇提取法等，這些方法常用于克級以上的油脂樣品分析，樣品量大。本試驗成功運用微量提取技術分析了沙棘種子中總脂肪酸的含量及組成，該方法不需要大量樣品，還可避免提取過程中的脂肪酸（尤其是不飽和脂肪酸）氧化分解產生的誤差，另外，甲酯化方法具有操作簡單、效率高、準確以及重現性好的優點，非常適合毫克級樣品的油脂分析。該方法對于指導種子的資源考察、品種評價等具有一定的應用價值。

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