柱穗山羊草類燕麥儲藏蛋白基因克隆和序列分析

杜旭燁　周婷婷　許驥坤　郭偉華　趙小龍　翟軍　孔令讓

摘 要：從小麥近緣植物柱穗山羊草中克隆得到一個特殊的類燕麥儲藏蛋白（Avenin-like protein）基因。其編碼區比已知的類燕麥儲藏蛋白編碼基因長200 bp左右，是迄今發現的最大的類燕麥儲藏蛋白，將其命名為AL-Y127。通過與已知的類燕麥儲藏蛋白基因比較后發現，該蛋白家族在信號肽、N末端和C末端具有很高的保守性，而在重復區中則具有較大的序列差異。AL-Y127中有26個半胱氨酸殘基，遠多于已知的avenin-like蛋白中的半胱氨酸殘基數目，這些半胱氨酸殘基可能會參與形成更多的二硫鍵，有利于提高面粉的加工品質。

關鍵詞：類燕麥儲藏蛋白；基因克隆；序列分析

中圖分類號：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Novel Avenin-Like Genes

from Aegilops cylindrical

Du XuYe1， 2， Zhou TingTing1， Xu JiKun1， Guo WeiHua1，

Zhao XiaoLong1， Zhai Jun1， 2， Kong LingRang1， 2*

（1.Agronomy College， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2.State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

Abstract A novel avenin-like gene was cloned from Aegilops cylindrical. Its coding region the gene was 200 bp longer than that of published avenin-like gene and it was named AL-Y127. This gene is the largest avenin-like gene so far. It showed that the signal peptide， N-terminal domain and C-terminal domain of avenin-like protein were highly conservative by comparing AL-Y127 and the other published avenin-like proteins. The repetitive domain displayed more variation based on protein sequence alignment. There were 26 cysteine residues in AL-Y127， which were much more than these of the avenin-like proteins in other species； they may form more disulfide bond which have the positive role in the processing quality of flour.

Key words Avenin-like proteins； Clone； Sequence analysis

小麥籽粒的儲藏蛋白主要包括谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白是多聚體蛋白，由分子內部的二硫鍵結合形成蛋白聚合體；而醇溶蛋白是一類單體蛋白，根據其在酸性電泳中的遷移率可以分為α、γ和ω醇溶蛋白三類。

類燕麥儲藏蛋白是最近幾年引起人們關注的一類儲藏蛋白。最初，Salcedo等[1]報道了一種低分子量的醇溶蛋白，隨后Anderson和Clarke[2，3]得到了此類蛋白的cDNA序列，Kan等[4]分析后認為此類蛋白與燕麥種子的儲藏蛋白具有最近的親緣關系，因此將其命名為類燕麥儲藏蛋白（Aevnin-like protein）。根據其結構可將其分為兩類：a型和b型類燕麥儲藏蛋白。

序列分析表明，a型類燕麥儲藏蛋白類似于低分子量谷蛋白亞基，通過蛋白組學分析和蛋白質分離已經得到了該類型的類燕麥儲藏蛋白。目前對b型類燕麥儲藏蛋白的研究較少，Kan等[4]發現，一些b型類燕麥儲藏蛋白中含有19個半胱氨酸殘基，認為它們可以通過分子鏈內的二硫鍵結合到谷蛋白聚合體中。

柱穗山羊草（CCDD）是小麥的近緣植物之一，由于其外形與粗山羊草十分相似，因此常常被誤認為是粗山羊草。目前對它的研究較少。本文從柱穗山羊草中克隆得到了一個特殊的類燕麥儲藏蛋白基因，并對其編碼序列及氨基酸序列進行了分析。

1 材料與方法

11 供試材料

柱穗山羊草京Y127，由中國農業科學院作物科學研究所提供。Trans T1感受態細胞、pEASY-T1克隆載體、Hifi Taq高保真酶均購于北京全式金公司。基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

12 方法

121 基因組DNA提取 以室內生長2周的幼葉為材料，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，操作方法依照試劑盒內說明書進行。

122 基因克隆及序列測定 根據GenBank公布的avenin-like蛋白編碼基因的保守序列（表1）

表1

引物設計的參考序列

基因來源 GenBank登錄號

小傘山羊草 EU096528

柱穗山羊草 EU096537

長穗偃麥草 EU096540

雙角山羊草 EU096546

普通小麥 HM027637

普通小麥 JN542459

設計引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如下：P1：5′-ATGAAGGTCTTCATCCTGGCT-3′；P2：5′-CTAGCACGCACCACCAGT-3′。該引物可覆蓋avenin-like蛋白編碼基因的起始密碼子至終止密碼子的編碼區。

123 序列分析 利用http：//webexpasyorg/translate/在線工具進行氨基酸序列的翻譯；DNAMAN 60軟件用于序列的多重比對分析。

2 結果與分析

21 柱穗山羊草類燕麥儲藏蛋白基因的PCR擴增

利用特異性引物經PCR擴增，獲得了一條大小約為1 000 bp的條帶（圖1），經菌落PCR鑒定后（圖2），隨機選擇10個單菌落進行測序。測序結果經多重序列比對后，確定得到兩個avenin-like蛋白編碼基因，其中一個為從未報道過的新基因，命名為AL-Y127。

注：1，DNA ladder；2，avenin-like蛋白編碼基因PCR擴增產物。

圖1 PCR擴增產物

22 與已知序列的比較分析

經過與已知的avenin-like蛋白編碼基因進行比較（表2）發現，本試驗所得到的編碼基因長

注：M，DNA ladder；1～12， 菌落PCR產物，其中泳道12為AL-Y127。

圖2 菌落PCR

度大于已知的此類基因，同時其半胱氨酸的殘基數目較多，為26個，而在已知的avenin-like蛋白編碼基因中，半胱氨酸殘基數目最多為19個。因此，本試驗得到的蛋白可以形成更多的二硫鍵，有利于提高面粉的加工品質。

與已知的avenin-like蛋白進行多重序列比對（圖3）發現，此類蛋白有保守的信號肽、N-末端以及C-末端，而主要的變異幾乎全部來自重復區。只是AL-Y127的重復區更長。

表2 AL-Y127與已知類燕麥儲藏蛋白的

序列比較

蛋 白 氨基酸數目 半胱氨酸殘基數目 等電點 分子量（ku）

AL-Y127 404 26 696 4624

EU096528 284 18 783 3233

EU096537 284 18 843 3233

EU096540 284 18 783 3233

EU096547 284 19 781 3201

HM027637 284 18 783 3236

JN542459 284 18 741 3239

注：Ⅰ，信號肽；Ⅱ，N-末端；Ⅲ，重復區；IV，C-末端；箭頭，保守的半胱氨酸殘基；方框，AL-Y127中額外的半胱氨酸殘基。

圖3 AL-Y127與已知的avenin-like蛋白多重序列比對

3 討論與結論

為了研究柱穗山羊草中的avenin-like蛋白，本試驗從柱穗山羊草京Y127中分離出一個迄今未見報道的高分子量的avenin-like蛋白，其編碼基因為1 212 bp，表達的蛋白質由404個氨基酸殘基組成，比已知的avenin-like蛋白的氨基酸多100多個；其半胱氨酸殘基的數目多達26個，比同家族的蛋白多8個左右，比大多數的高分子量谷蛋白亞基多約20個。陳瑞佶等[5]認為，avenin-like蛋白中的半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵既可以形成分子內二硫鍵，也可以和其他的儲藏蛋白形成分子間二硫鍵。目前對小麥儲藏蛋白中二硫鍵的作用已經形成了廣泛的共識，即二硫鍵的數目和位置會直接影響面粉的加工品質，因此，avenin-like蛋白對改良小麥品質具有重要的潛力。

Salvatore等[6]認為，avenin-like蛋白作為小麥的儲藏蛋白，與已知的小麥儲藏蛋白表現出一些共性，例如在其編碼基因的結構上，兩端均為保守序列，變異發生在重復區中。本試驗的多重序列比對表明（圖3），AL-Y127與已知的avenin-like蛋白序列的差異主要體現在重復區中，而在信號肽、N末端以及C末端的序列則相對保守。陳鵬等[7]研究發現，avenin-like蛋白基因屬于多基因家族，因此，上述的分子結構為此類基因的同源克隆創造了條件，利于從更多的材料中克隆出該基因并進行功能分析。

本試驗克隆獲得的avenin-like蛋白基因具有高分子量以及高半胱氨酸含量，其結構分析表明該蛋白為一個優質蛋白，而對于其具體的功能以及利用該蛋白改良小麥的品質還有待于進一步的研究。

參 考 文 獻：

[1] Salcedo G， Prada J， Aragoncillo C Low MW gliadin-like proteins from wheat endosperm[J] Phytochemistry，1979，18（5）：725-727

[2] Anderson O D， Hsia C C， Adalsteins A E，et alIdentification of several new classes of low-molecular-weight wheat gliadin-related proteins and genes[J] Theoretical and Applied Genetics ， 2001， 103（2-3）： 307-315

[3] Clarke B C， Phongkham T， Gianibelli M C，et al The characterization and mapping of a family of LMW-gliadin genes： Effects on dough properties and bread volume[J] Theoretical and Applied Genetics ， 2003， 106（4）： 629-635

[4] Kan Y C， Wan Y F， Beaudoin F， et alTranscriptome analysis reveals differentially expressed storage protein transcripts in seeds of Aegilops and wheat[J] Journal of Cereal Science， 2006， 44（1）： 75-85

[5] 陳瑞佶，高 翔，陳其皎，等小麥品種陜253新型Avenin-like的克隆與原核表達分析[J]中國農業科學， 2010， 43 （9）： 1954-1962

[6] De Caro S，Ferranti P，Addeo F，et al Isolation and characterization of Avenin-like protein type-B from durum wheat[J]Journal of Cereal Science， 2010， 52（3）： 426-431

[7] 陳 鵬， 李 茹， 金 剛， 等 三芒山羊草中新型儲藏蛋白基因Avenin-like的克隆及分析[J] 生物技術， 2009， 19（4）： 1-3 山 東 農 業 科 學 2012，44（11）：12～16