兩步多重RT-PCR快速檢測蘋果潛隱性病毒

摘要： 【目的】為建立檢測3種蘋果潛隱性病毒更為快速準確的方法，【方法】以攜帶蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）和蘋果莖痘病毒（ASPV）的成齡蘋果樹韌皮部為試材，根據基因庫中蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）的外殼蛋白基因序列，設計合成了2對特異性引物，分別與合成的蘋果莖溝病毒（ASGV）引物和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）的引物組合配伍，篩選出最佳的引物對組合。對cDNA的合成所用引物和總RNA模板進行遴選和量化，對PCR過程中cDNA的用量、引物對的終濃度、退火溫度等主要影響因素進行優化。【結果】結果表明，反轉錄引物為Oligo（dT）18、總RNA 0.1～3.0 μL時，可以得到較好的cDNA；ASPV-FR與ASGV-Pch、ACLSV-Pch 引物組合優于ASPV-Pch，并且篩選出4組最佳的終濃度處理組合；cDNA用量為2.0～4.0 μL、退火溫度為50.0～52.9 ℃、循環數為35時，擴增效果較好。采用優化的多重RT-PCR體系對采自陜西和山東兩省的樣品進行檢測，并用3種病毒的單重RT-PCR體系進行驗證。【結論】結果呈現高度一致性，充分印證了該多重RT-PCR體系的準確性，適用于大量樣品的快速檢測。