抑制Cyclin D1基因對K562細胞生長和VP16敏感性的影響

王 一，連小云，張 玎，王歧山

（陜西省人民醫院血液科，陜西西安 710068）

·論 著·

抑制Cyclin D1基因對K562細胞生長和VP16敏感性的影響

王 一，連小云，張 玎，王歧山

（陜西省人民醫院血液科，陜西西安 710068）

目的應用RNA干擾技術（RNA interference，RNAi），構建針對細胞周期素D1（Cyclin D1）的RNAi，并檢測其對K562細胞增殖和對化療藥物敏感性的影響。方法采用針對Cyclin D1的RNAi質粒載體轉染K562細胞，用反轉錄-聚合酶鏈反應和Western blot法檢測Cyclin D1RNAi后mRNA和蛋白水平的表達；用MTT實驗測定細胞的增殖；流式細胞術測定細胞周期和凋亡。結果針對Cyclin D1 RNAi轉染白血病K562細胞后，可以明顯降低白血病K562細胞中Cyclin D1的mRNA和蛋白的表達，明顯抑制K562細胞的增殖，提高化療藥物Vp16誘導的細胞凋亡。結論利用RNAi抑制Cyclin D1可抑制白血病K562細胞增殖，提高對化療藥物Vp16的敏感性。

白血病；RNA干擾；細胞凋亡

細胞周期素D1（Cyclin D1）為調節細胞增殖的重要分子，在調節細胞周期的過程中起重要作用，Cyclin D1分子在正常細胞中表達很低，不易被檢測。Cyclin D1在多種腫瘤細胞中表達為預后不良的獨立因素，提示Cyclin D1的表達可能與腫瘤的發生密切相關，Cyclin D1基因有可能成為腫瘤治療的靶點［1-4］。而 RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）因為其對靶基因的特異性抑制作用而受到關注。本研究采用RNAi技術研究抑制K562白血病細胞中Cyclin D1的表達對其增殖、細胞周期等的影響，探討Cyclin D1影響白血病細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及其培養：髓系白血病K562細胞株為本科實驗室保存。將細胞從液氮中復蘇后，用含10%小牛血清的 RPMI1640培養基，在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下進行培養，至細胞處于對數生長期時，進行后續實驗。

1.2 試劑與溶液：已經構建成功的對Cyclin D1起抑制作用的含U6啟動子的干擾質粒PGE-Cyclin D1載體以及陰性載體，反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑（promega公司），兔抗人-Cyclin D1一抗、兔抗兔-HRP二抗均為santa cruz產品。氨芐青霉素（上海生物工程公司）、G418（Sigma）、Vp16（Sigma）。

1.3 轉染和陽性克隆的篩選：按照MERCK公司Genejammer（R）Transferction Reagent DMRIEReagent脂質體產品說明書中轉染貼壁細胞方法稍作改動。將轉染36h后的K562細胞培養，加入濃度遞增的G418進行陽性克隆的篩選。并將陽性克隆進行增殖待用。

1.4 RT-PCR：按Trizol試劑盒（GIBCOBRL）說明，收集細胞，用PBS洗滌后，提取總RNA。取2μg總 RNA，引物 Oligdt（17）（GIBCOBRL）應用 Super ScripⅡ試劑盒（GIBCOBRL）按說明逆轉錄成cDNA（20μL體系）。根據GeneBank已知序列，設計引物Cyclin D1 上 游 引 物 5′ -CCCTCGGTGTCCTACTTCAA-3’下游引物 5′-GTGTTCAATGAAATCGTGCG-3′（擴增片段長度為726bp）； β - actin 上 游 引 物 5′ -CCAGGCACCAGGGCGTGATG-3′，下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3′（擴增片段長度為436bp）。PCR反應系統為50μL體系（cDNA 2μL，引物濃度400nmol/L，Taq酶1U），反應條件為，94℃ 5min，94℃變性1min，72℃延伸1min，βactin的退火溫度為63℃，而Cyclin D1的退火溫度為64.5℃退火45s，共進行35個循環，最后在72℃延伸5min。取5μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖電泳，紫外照像。

1.5 Western blot：分析Cyclin D1，β-actin蛋白的表達，收集細胞，離心并用PBS洗滌后加入100μL RIPA細胞裂解液和cock-tail蛋白酶抑制劑，離心去除細胞碎片后，用BCA法測定蛋白濃度，加入5× SDS buffer，煮沸5min，在10%SDS-聚丙烯凝膠中每孔加入總蛋白為 50μg樣品，電泳后，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉過夜，分別加入兔抗人-Cyclin D1多抗和鼠抗人-β-actin單抗，印跡產物相對分子質量分別為34 000、43 000，4℃過夜，再分別與相應的二抗室溫反應1h后，化學發光底物顯色。

1.6 細胞生長曲線和增殖抑制實驗：將G418篩選的陽性細胞種于12孔板中，于培養后0、3、6、9、12d收集細胞，用臺盼藍拒染實驗計數活細胞，描繪生長曲線，并將G418篩選的陽性細胞種于96孔板中，加入不同濃度的 Vp16培養 48、72h，加入 MTT（5g/L）繼續培養4h后，去除上清，加入100μL/孔DMSO充分混勻后在570nm和650nm測吸光度值，再按照 Bliss法計算程序，求出半數抑制濃度（IC50）。

1.7 流式細胞儀測定細胞周期：收集待測細胞，PBS洗滌后，70%預冷乙醇固定過夜。PBS洗滌后，加入PI/RNase（10mg·L-1/0.2g·L-1）避光30min后，在流式細胞儀上用488nm激發光檢測DNA含量，并用BD lysis software（Becton-Dickinson）軟件分析細胞周期。

1.8 流式細胞儀測定細胞凋亡率：將細胞收集離心，PBS洗滌，孵育液 100μL，重懸細胞；加入Annexin-V-FITC標記的抗體10μL，避光孵育15min；加入5μL（50mg/L）PI，再避光10min后，用孵育液洗去多余抗體和 PI，1h內上機檢測，Annexin-V-FITC+/PI-的細胞為凋亡細胞。

1.9 統計學方法：應用SPSS16.0軟件包進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，組內兩兩比較，采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 穩定轉染PGE-siRNA CD1對K562細胞Cyclin D1mRNA和蛋白水平的影響：本研究結果顯示PGE-siRNACD1穩定轉染到K562細胞，可在mRNA和蛋白水平上明顯抑制K562細胞中Cyclin D1的表達，見圖1，2。

圖1 PGE-siRNA Cyclin D1穩定轉染對K562細胞Cyclin D1mRNA表達的影響1.DNA marker；2.未轉染；3.轉染 PGE-siRNA；4.轉染 PGE-siRNACyclin D1Figure 1 Expression of Cyclin D1 mRNA in K562 cells stably transfeeted with transfection PGE-siRNA Cyclin D1A.DNA marker；2.Not transfection；3.Transfection by PGE-siRNA；4. Transfection by PGE-siRNA Cyclin D1

圖2 PGE-siRNA Cyclin D1穩定轉染對K562細胞Cyclin D1蛋白表達的影響1.DNA marker；2.未轉染；3.轉染PGE-siRNA；4.轉染PGE-siRNA Cyclin D1Figure 2 Protein expression of Cyclin D1 in K562 cells stably transfeeted with transfection PGE-siRNA Cyclin D11.Not transfection；2.Transfection by PGE-siRNA；3.Transfection by PGE-siRNA Cyclin D1

2.2 PGE-siRNA Cyclin D1轉染對K562細胞周期的影響：與野生型K562細胞和轉染PGE-siRNA（PGE中含陰性片段質粒）相比較，PGE-siRNA Cyclin D1轉染后明顯增加G1期細胞，減少S期細胞。PGE-siRNA Cyclin D1轉染后并不能增加K562細胞的凋亡，見表1。

表1 PGE-siRNA Cyclin D1對K562細胞細胞周期的影響作用Table 1 Effect of PEG-siRNA Cyclin D1 on cell cycle of K562 cells（±s）

表1 PGE-siRNA Cyclin D1對K562細胞細胞周期的影響作用Table 1 Effect of PEG-siRNA Cyclin D1 on cell cycle of K562 cells（±s）

*P＜0.05 vs negative control by q test

Groups S-G1 G1 S G2-M Negative control 1.2±0.4 48.6±8.7 30.4±12. 22.3±3.2 14.3±5.9 1 19.8±2.8 PGE-siRNA-N 4.7±1.7 49.5±9.3 23.5±4.6 22.3±5.7 PGE-siRNA CD1 5.9±2.4 57.5±4.7*

2.3 穩定轉染PGE-siRNA Cyclin D1K562細胞生長的影響：600mg/L G418的培養液篩選出來的陽性K562細胞調節為2×105/mL培養于6孔板，分別于3、6、9、12d，用苔盼藍拒染法計數活細胞數，實驗重復2次，取平均值描繪生長曲線。結果提示PGE-siRNA Cyclin D1穩定轉染于K562細胞，與轉染含陰性片段的細胞相比較，PGE-siRNA Cyclin D1可明顯抑制K562細胞的生長。細胞培養12d后，與陰性對照比較，對K562細胞的抑制率為（57.36± 7.67）%，見圖3。

圖3 PGE-siRNA Cyclin D1對K562細胞生長的影響Figure 3 Effect of PGE-siRNA Cyclin D1 on the proliferation of K562 cells

2.4 穩定轉染PGE-siRNA Cyclin D1K562細胞對化療藥物Vp16敏感性和凋亡率的影響：用MTT法檢測Vp16對穩定轉染 PGE-1-Cyclin D1和PGE-1-Neo的K562細胞48、72h的IC50值結果顯示PGE-siRNACyclin D1穩定轉染于K562細胞后，可以明顯降低48、72h的IC50值，見表2。

表2 PGE-siRNA Cyclin D1 K562對Vp16的影響Table 2 Sensitivity of K562 cells transfected with PGE-siRNA Cyclin D1 to VP16（±s）

表2 PGE-siRNA Cyclin D1 K562對Vp16的影響Table 2 Sensitivity of K562 cells transfected with PGE-siRNA Cyclin D1 to VP16（±s）

*P＜0.05對照組比較by t test

PGE-siRNACD1 PGE-siRNA IC50（48h）g/L 62.3±4.5 46.7±9.4*空白對照49.3±6.2 58.1±3.5 IC50（72h）g/L 54.1±10.5 39.6±7.21*

用 200mg/L Vp16處理 K562細胞 12h后，PGE-siRNA CD1 K562細胞凋亡率為27.4%，明顯高于野生型K562和PGE-siRNA，其細胞凋亡率分別為12.5%和18.2%。見圖4。

圖4 Vp16對K562細胞凋亡的Annexin-V/PI測定A.野生型K562細胞凋亡率；B.PGE-siRNAneoK562細胞凋亡率；C.PGE-siRNA Cyclin D1K562細胞凋亡率Figure 4 Apoptosis of K562 cells treated by Vp16 detected using Annexin-V/PIA.apoptosis rate in wild K562 cells；B.Apoptosis rate in PGE-siRNAneoK562 cells；C.Apoptosis rate in PGE-siRNA Cyclin D1-K562 cells

3 討 論

Cyclin D1為作用于G1期的細胞周期蛋白，可與CDK4和（或）CDK6結合形成復合物，與Rb蛋白結合使其活化，使細胞由G1期進入S期，細胞周期縮短，細胞增殖，而正常細胞Cyclin D1的合成具有時效周期，因此，平時很難檢測到其表達［2-4］。套細胞淋巴瘤由于在bcl-1斷裂點發生染色體易位t（11；14）（q13；q32）使免疫球蛋白重鏈的增強子轉移至CCND1位點，促進了Cyclin D1蛋白合成和過度表達，并成為區別于其他B細胞淋巴瘤的分子學特征。而在乳腺癌、肝癌等實體瘤以及白血病細胞中Cyclin D1過表達，已經成為影響疾病預后的獨立因素之一［6-9］。

本研究利用對Cyclin D1表達起明顯抑制作用的真核RNA干擾質粒轉染K562白血病細胞，結果顯示干擾質粒轉染K562細胞后可在mRNA和蛋白水平上明顯抑制Cyclin D1分子的表達，Cyclin D1表達降低同時，G1期的細胞數量增多，S1期細胞減少，以此相對應的結果是，Cyclin D1表達降低后，K562細胞生長、增殖受到明顯抑制。我們的研究結果顯示，靶向抑制K562細胞Cyclin D1基因的表達后，可增加K562細胞對常規化療藥物Vp16的敏感性，同時觀察到抑制K562細胞中Cyclin D1的表達可以增加Vp16誘導白血病細胞的凋亡。有趣的是，Vp16是一種作用于G2期的抗腫瘤藥物，我們的研究發現，K562細胞Cyclin D1表達降低后，G1期細胞比例增加，對G2期的細胞影響不大，提示K562細胞Cyclin D1表達降低增加對Vp16敏感性的原因與細胞周期改變無關，其可能的機制為K562細胞中D1表達降低，G1期細胞增多，細胞進入G2期的數量減少，使Vp16作用的靶細胞相對增多，導致Vp16敏感性增加。

本研究初步觀察到利用shRNA靶向抑制K562白血病細胞中Cyclin D1的表達可以明顯抑制白血病K562細胞的增殖，并增加其對化療藥物的敏感性。為進一步深入研究Cyclin D1在白血病的發生、發展的作用提供了研究基礎，同時也反向證明了Cyclin D1在白血病增殖中的促進作用以及Cyclin D1影響白血病預后的可能原因，揭示以Cyclin D1為抗白血病治療的靶點，聯合化療可能會對Cyclin D1過表達的白血病患者治療有益。

不少研究表明Cyclin D1在白血病中表達增高與P27、P57、survivin表達密切相關，可能在這些分子的共同作用之下，導致白血癥預后不佳［10-12］。這些研究結果提示，通過RNA干擾方法抑制白血病K562細Cyclin D1表達，也直接或者間接調節了包括P53、P27和survivin等分子的表達，在這些信號分子的共同作用下使白血病細胞的增殖和對化療藥物敏感性發生改變。本研究中僅初步觀察 Cyclin D1表達了的下調對白血病K562細胞增殖和對常規化療藥物Vp16敏感性的影響，而Cyclin D1表達下調后是否對其他細胞周期蛋白的表達有無影響需要進一步研究。

［1］ 王前，鄧晶，蔣永新.Cyclin D1的研究進展［J］.現代腫瘤醫學，2009，17（2）：352-352.

［2］ 許寧，朱恩新，王莉紅，等.Cyclin D1表達異常與腫瘤的發生及預后［J］.中國藥物與臨床，2008，11（8）：840-842.

［3］ YAN KX，LIU BC，SHI XL，et al.Role of cyclinD1 and CDK4 in the carcinogenesis induced by silica［J］.Biomed Environ Sci，2005，18（5）：286-296.

［4］ SENGUPTA A，BANERJEE D，CHANDRA S，et al.Deregulation and cross talk among sonic hedgehog，wnt，hox and notch signaling in chronic myeloid leukemia progression［J］.Leukemia，2007，21（5）：949-955.

［5］ UMEKITA Y，OHI Y，SAGARA Y，et al.Overexpression of cyclinD1 predicts for poor prognosis in estrogen receptornegative breast cancer patients［J］.Int J Cancer，2002，98（3）：415-418.

［6］ MASUDA M，SUZUI M，YASUMATU R，et al.Constitutive activation of signal transducers and activators of transcription correlates with cyclin D1 overexpression and may provide a novel prognostic marker in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res，2002，15（62）：3351-3359.

［7］ 劉壯，韋紅英，韓蘊麗，等.細胞外信號調節激酶-1、細胞周期蛋白D 1表達與兒童急性白血病關系研究［J］.臨床兒科雜志，2005，23（5）：286-288.

［8］ 李紅華，汪月增，樓方定，等.急性白血病患者周期蛋白D1 mRNA表達及其臨床意義［J］.中華血液學雜志，1999，20（7）：357-359.

［9］ 吳穗晶，杜欣，陳運賢，等.細胞周期蛋白與急性白血病預后的關系研究［J］.癌癥，2003，22（8）：852-854.

［10］ HUI AM，LI X，SHI YZ，et al.Cyclin D1 overexpression is a critical event in gallbladder carcinogenesis and independently predicts decreased survival for patients with gallbladder carcinomal［J］.Clin Cancer Res，2000，6（11）：4272-4277.

［11］ 劉壯，韋紅英，韓蘊麗，等.細胞外信號調節激酶-1、細胞周期蛋白D1表達與兒童急性白血病關系研究［J］.臨床兒科雜志，2005，23（5）：286-288.

［12］ 王凡平，孫志強，李辰蕊，等.P27kip1和P57kip2與CyclinD1在急性白血病的表達其臨床意義［J］.臨床血液學雜志，2008，21（1）：22-24.

（本文編輯：劉斯靜）

EFFECT OF Cycline D1 GENE SILENCING ON THE GROWTH OF HUMAN K562 LEUKEMIC CELLS AND THE SENSITIVITY AGAINST VP16

WANG Yi，LIAN Xiaoyun，ZHANG Ding，WANG Qishan
（Department of Hematology，the People′s Hospital of Shanxi Province，Xi′an 710068，China）

ObjectiveTo observe the gene silencing mediated by the specific RNAi targeted against Cyclin D1 and its effect on biological activity of human K562 leukemia cells.MethodsRNAi plasmid vectors against Cyclin D1 were transfected into K562 leukemia cells.Cell activation was analysed by trypan blue reject test and cell proliferation inhibitions were determined by MTT assay.Cyclin D1 expressions were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and western blot analysis.Cell cycle distribution and apoptosis was examined by flow cytometry.ResultsThe RNAi vector targeted against Cyclin D1 efficiently suppressed Cyclin D1 expression at mRNA and protein levels.The RNAi-mediated gene silencing of Cyclin D1 resulted in significant inhibition of cell. Moreover，the cancer cells showed significant increased ratio of G1 phase，decreased ratio of S phase，and increased apoptosis induced by Vp16.ConclusionThe specific RNAi targeted against Cyclin D1 could inhibit cell growth and increase sensitivity against Vp16 in K562 leukemia cells.

RNA interference；leukemia；apoptosis

R733.71

A

1007-3205（2012）09-1008-04

2011-09-07；

2012-03-07

王一（1971-），女，四川資中人，陜西省人民醫院副主任醫師，醫學博士，從事血液系統疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.006