EDTA依賴性假性血小板減少的臨床和實(shí)驗(yàn)室分析

李 波，史 敏，宋 軍，高羽高，王 燕

（1.河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心預(yù)防性健康體檢所，河北石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000）

·論 著·

EDTA依賴性假性血小板減少的臨床和實(shí)驗(yàn)室分析

李 波1，史 敏2*，宋 軍2，高羽高2，王 燕2

（1.河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心預(yù)防性健康體檢所，河北石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000）

目的對(duì)乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）患者進(jìn)行臨床和實(shí)驗(yàn)室分析，并初步探討其產(chǎn)生機(jī)制。方法比較儀器法測(cè)定及手工法計(jì)數(shù)的血小板結(jié)果；采用瑞-姬染色法觀察D抗凝和不抗凝血涂片中血小板形態(tài)；采用間接免疫熒光法檢測(cè)免疫球蛋白抗體IgG、IgA和IgM。結(jié)果①EDTA-PTCP的發(fā)生率為1.17%，多發(fā)生于老年人，與性別無關(guān)，心血管疾病患者的發(fā)生率較高；②EDTA-K2抗凝血在血細(xì)胞分析儀上測(cè)定的血小板計(jì)數(shù)值［（41.15±19.1）× 109/L］明顯低于手工法計(jì)數(shù)血小板計(jì)數(shù)值［（181.6±75.3）×109/L］（P＜0.05）；③假性血小板減少癥（pseudothrombocyto penia，PTCP）患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態(tài)明顯不同；④PTCP患者多表達(dá)IgG或IgM抗血小板抗體。結(jié)論應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定EDTA抗凝血可引起PTCP的發(fā)生，這可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關(guān)。

血小板減少；血小板計(jì)數(shù)；抗血小板聚集抑制劑

KEY WORDS：thrombocytopenia；platelet count；platelet aggregation inhibitors

近年來，由多種原因引起的乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTAPTCP）常見報(bào)道［1］。PTCP是一種由抗凝劑在體外激活血小板發(fā)生凝集反應(yīng)，從而導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)假性降低的現(xiàn)象，本身并無病理意義［2］。EDTA鹽能有效保持細(xì)胞形態(tài)和防止血小板聚集，是國內(nèi)外全自動(dòng)血液分析儀普遍采用的一種抗凝劑，但少數(shù)情況下有可能導(dǎo)致 PTCP，即 EDTA依賴性 PTCP（EDTA-PTCP）。對(duì)PTCP的認(rèn)識(shí)不足常會(huì)導(dǎo)致不必要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、延誤治療以及由此引發(fā)輸血并發(fā)癥［3］。為探討其發(fā)生原因，本文對(duì)895例健康體檢者及1 250例住院患者進(jìn)行了血小板計(jì)數(shù)觀察，并對(duì)其中出現(xiàn)EDTA-PTCP的25例患者進(jìn)行了臨床和實(shí)驗(yàn)室分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：選取2008年3月—2010年3月住院患者1 250例，健康體檢者895例，在進(jìn)行血常規(guī)分析時(shí)，對(duì)血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L的標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢，其中鏡檢發(fā)現(xiàn)血小板聚集成團(tuán)的，與計(jì)數(shù)明顯不符的，即為EDTA-PTCP，定為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.2 方法：儀器包括全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（CD3700，美國雅培公司），熒光顯微鏡（XSP-08/ YZ-1，日本OLYMPUS公司），光學(xué)顯微鏡（CX21，日本OLYMPUS公司），牛鮑計(jì)數(shù)盤（江蘇鹽城錦輝玻璃儀器廠），EDTA-K2真空采血管（威海鴻宇醫(yī)療器械有限公司），37℃溫箱（無錫瑞智科技有限公司），搪瓷桶3只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1 500mL），有蓋搪瓷盒1只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|），玻片架，濾紙。試劑包括全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀配套試劑，草酸銨稀釋液，瑞-姬染液，磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L，pH7.4；緩沖甘油，分析純無熒光的甘油9份和0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.2）1份配制；熒光標(biāo)記的多克隆兔抗人免疫球蛋白抗體（IgG，IgM，IgA）（Abcam公司），以0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液1∶200進(jìn)行稀釋。

1.2.1 儀器法：安靜狀態(tài)下順利抽取5mL靜脈血，其中2mL靜脈血加入到EDTA-K2抗凝管中，立即混勻，1h內(nèi)在血細(xì)胞分析儀上檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)；3mL靜脈血靜置2h，3 000r/min離心10min，留取血清檢測(cè)血小板抗體。

1.2.2 手工法：取靜脈血20μL加入到0.38mL草酸銨的稀釋液中，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版的操作方法進(jìn)行血小板手工計(jì)數(shù)。

1.2.3 血涂片鏡檢：在抽取靜脈血同時(shí)，取10μL血立即涂片，作為涂片A，再用EDTA-K2抗凝血進(jìn)行涂片，標(biāo)為涂片B，行瑞-姬染色后，在油鏡下觀察血小板分布情況。

1.2.4 間接免疫熒光法檢測(cè)抗體：①滴加0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。②滴加以0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液200倍稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。③取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗1～2次，然后按順序過0.01mol/L、pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。④取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴1∶200稀釋的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。⑤將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。⑥重復(fù)操作3。⑦取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。⑧熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.3 結(jié)果判定：（ -）無熒光；（ ±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（ ++）熒光明亮；（+++ ～ ++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EDTA-PTCP的發(fā)生率及臨床分析：1 250例住院患者中發(fā)生EDTA-PTCP 23例（1.84%），健康體檢者895例中發(fā)生2例（0.22%），25例EDTAPTCP中，男性14例，女性11例，年齡25～71歲，平均52.4歲。其中＜40歲有8例，≥40歲17例；心血管疾病13例，惡性腫瘤2例，肝臟疾病4例，免疫性疾病2例，重癥感染4例。

2.2 血小板2種計(jì)數(shù)方法的比較：使用EDTA-K2抗凝管在血細(xì)胞分析儀上測(cè)定的血小板計(jì)數(shù)值為（41.15±19.1）×109/L，手工法計(jì)數(shù)血小板計(jì)數(shù)值為（181.6±75.3）×109/L，EDTA-K2抗凝管血小板計(jì)數(shù)值明顯高于手工法計(jì)數(shù)血小板計(jì)數(shù)值，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 血小板形態(tài)學(xué)檢查：涂片經(jīng)瑞-姬染色在油鏡下觀察顯示，涂片A中血小板數(shù)量較多，呈自然成堆分布，且血小板形態(tài)清晰（圖1A）。涂片B中血小板明顯聚集成簇，甚至聚集成大片狀，血小板數(shù)10～50個(gè)不等，且血小板形態(tài)模糊，邊界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒細(xì)胞周圍（圖1B）。

2.4 免疫球蛋白抗體的檢測(cè)：IgG，IgM，IgA抗體在25例EDTA-PTCP患者中表達(dá)有所不同，其中IgG 8例，IgM 14例，IgA 3例。

圖1 患者外周血血小板形態(tài)學(xué)A.不抗凝血血小板；B.EDTA抗凝血血小板Figure 1 Platelete morphology in patient′s peripheral blood smear A.non-anticoagulated blood；B.EDTA-anticoagulated blood

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，在健康體檢者和住院患者中EDTA-PTCP的發(fā)生率較少（1.17%），心血管疾病患者的發(fā)生率較高；PTCP患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態(tài)明顯不同；PTCP的發(fā)生機(jī)制可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關(guān)。

血小板在體內(nèi)主要參與止血與血栓形成，有著非常重要的生理功能，是臨床最常用的檢驗(yàn)項(xiàng)目之一，因此血小板數(shù)量檢測(cè)的準(zhǔn)確度至關(guān)重要。目前血小板的檢測(cè)方法主要是應(yīng)用血細(xì)胞分析儀對(duì)抗凝血進(jìn)行檢測(cè)。抗凝劑的種類多樣，而EDTA-K2抗凝劑是國際血液標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的首選抗凝劑，其不影響血細(xì)胞形態(tài)，并可抑制血小板的聚集，在血液分析儀中廣泛應(yīng)用。國外報(bào)道EDTA-PTCP的發(fā)生率為0.07% ～0.20%，住院患者的發(fā)生率為1.9%，而且未發(fā)現(xiàn)與年齡、性別有關(guān)［4］。PTCP的發(fā)生與臨床用藥治療及機(jī)體自身情況有關(guān)。有研究［5］發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象常發(fā)生于重癥患者，與自身免疫疾病、腫瘤形成、心血管疾病或慢性肝臟病、病毒感染或膿毒癥有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，住院患者PTCP的發(fā)生率為1.84%，健康體檢者PTCP的發(fā)生率為0.22%，男性與女性的發(fā)生率相近，多為老年人；25例EDTA-PTCP患者中，心血管疾病13例，惡性腫瘤2例，肝臟疾病4例，免疫性疾病2例，重癥感染4例。表明EDTA-PTCP多發(fā)生于老年人，與性別無關(guān)，心血管疾病患者的發(fā)生率較高。

本研究結(jié)果還顯示，PTCP患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態(tài)明顯不同，EDTA抗凝血涂片中的血小板明顯聚集成簇，甚至聚集成大片狀，血小板10～50個(gè)，且血小板形態(tài)模糊，邊界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒細(xì)胞周圍，而非抗凝血血涂片則為自然成堆分布。這可能與血小板結(jié)合的抗體Fc段和單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞膜上Fc受體結(jié)合有關(guān)。在這種情況下，很可能影響血細(xì)胞分析儀對(duì)血小板計(jì)數(shù)及白細(xì)胞的分類，導(dǎo)致血小板假性降低。所以，對(duì)于在機(jī)測(cè)血小板結(jié)果＜100× 109/L、且無明顯的出血傾向如鼻出血、牙齦出血、紫癜、瘀點(diǎn)、瘀斑等體征且無法解釋血小板減少原因的患者，做血涂片進(jìn)行初步觀察，如發(fā)現(xiàn)有血小板聚集、堆積和發(fā)生衛(wèi)星現(xiàn)象等情況時(shí)，應(yīng)采指血用毛細(xì)血管模式測(cè)定，或用顯微鏡手工計(jì)數(shù)檢測(cè)，以得出真實(shí)性的血小板計(jì)數(shù)，為臨床提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免因假性血小板減少所造成的誤診。

PTCP是由免疫學(xué)介導(dǎo)的，在血液學(xué)中存在EDTA依賴性抗血小板抗體而導(dǎo)致的血小板聚集現(xiàn)象。抗血小板抗體通常為IgG或IgM，很少為IgA，這些抗體可以與來自正常個(gè)體的血小板發(fā)生反應(yīng)［6］。它們可能與某些隱藏的通常不能被檢測(cè)到的表面抗原發(fā)生反應(yīng)，主要表達(dá)于衰老或被破壞的血小板膜上。有研究［7］證實(shí)這些抗體不與患有Glanzamann′s病（即缺乏GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物）的血小板反應(yīng)，說明與EDTA依賴的抗體反應(yīng)的物質(zhì)應(yīng)包含GpⅡb/Ⅲa。在一些患者中發(fā)現(xiàn)一些自身抗體可以特異性地與GpⅡb發(fā)生反應(yīng)，GpⅡb通常隱藏在GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物中，但經(jīng)過EDTA與鈣離子鰲和作用，GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物分裂，GpⅡb暴露出來，與血小板抗體反應(yīng)，這種現(xiàn)象與低溫引起的血小板結(jié)構(gòu)改變有關(guān)［8］。本研究對(duì)PTCP患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在抗IgG抗體者8例，IgM抗體10例，IgA抗體3例，大都表現(xiàn)IgG或IgM抗體，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［6］。提示 IgG或 IgM抗體的存在可能是發(fā)生EDTA-PTCP的機(jī)制之一。

綜上所述，應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可引起PTCP的發(fā)生，可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關(guān)。如果在臨床工作中此種現(xiàn)象未被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，往往會(huì)給患者的診斷和治療帶來諸多麻煩，甚至?xí)疳t(yī)療糾紛，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)尤為重要。這就需要檢驗(yàn)工作者具備一定的責(zé)任心，當(dāng)在臨床工作中遇到血小板減少的患者時(shí)，首先應(yīng)仔細(xì)檢查人為因素和客觀因素，排除采血不當(dāng)、抗凝管用錯(cuò)等原因造成的血小板減少，其次做血涂片進(jìn)行瑞-姬染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，一旦發(fā)現(xiàn)血小板聚集、堆積和發(fā)生衛(wèi)星現(xiàn)象等情況，與機(jī)器計(jì)數(shù)明顯不符，再做人工血小板計(jì)數(shù)。丁胺卡那霉素能有效解離凝集的血小板，作用機(jī)制可能與抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC21和IgG的表達(dá)有關(guān)［9］，因此PTCP患者血常規(guī)樣品抽血后1h內(nèi)加入丁胺卡那霉素，有助于解決EDTA所致的血小板數(shù)的假性減少。

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（本文編輯：劉斯靜）

THE CLINICAL AND LABORATORY ANALYSIS OF EDTA-DEPENDENT PSEUDOTHROMBOCYTOPENIA

LI Bo1，SHI Min2*，SONG Jun2，GAO Yugao2，WANG Yan2
（1.Department of Health Examination，Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To analyze the clinical information and laboratory examinations in patients with ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia（EDTA-PTCP）and to explore its mechanism.MethodsThe results of platelet count between instrumental and manual method were compared；The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant and nonanticoagulant was examined using Wright-Giemsa staining.IgG，IgA and IgM immunoglobulin antibodies were detected using indirect immunofluorescence method.Results①The incidence rate of EDTAPTCP was 1.17%and EDTA-PTCP mostly occured in older people regardless of gender，the incidence rate of EDTA-PTCP patients with cardiovascular disease was higher.②The platelet count of EDTA-K2anticoagulated blood using blood cytoanalyzer method was significantly lower than that of the manual method.③The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant was significantly different from that in non-anticoagulant.④Patients with PTCP mostly express anti-platelet IgG or IgM antibodies.ConclusionPTCP may occur when EDTA anticoagulated blood is used and measured by blood cytoanalyzer method，which may be related to IgG or IgM autoantibodies.

R446.1

A

1007-3205（2012）09-1028-04

2012-02-02；

2012-04-25

李波（1971-），男，河北晉州人，河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心副主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究。

*通訊作者。E-mail：sm8344@hotmail.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.014