血紅素加氧酶-1在門靜脈高壓性胃病大鼠中的表達(dá)及意義

路新卿，劉志軍，李桂英，李校天，姜慧卿

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲 056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050000）

血紅素加氧酶-1在門靜脈高壓性胃病大鼠中的表達(dá)及意義

路新卿1，劉志軍1，李桂英1，李校天1，姜慧卿2*

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲 056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050000）

目的探討血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）在門靜脈高壓性胃病（portal hypertensive gastropathy，PHG）大鼠中的表達(dá)以及一氧化碳（carbonmonoxide，CO）在PHG中的可能作用。方法將SD大鼠隨機分成PHG組（n=16）與假手術(shù)組（n=12），采用HE染色觀察胃黏膜組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，八道生理記錄儀測量門靜脈壓力（portal venous pression，PVP），中性紅清除率方法測量胃黏膜血流量（gastric mucosal blood flow，GMBF），應(yīng)用免疫組織化學(xué)測定HO-1的表達(dá)定位，Western blot方法測定HO-1蛋白含量。結(jié)果PHG大鼠在光鏡下可見胃黏膜層毛細(xì)血管擴張，管腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞，同時有大量紅細(xì)胞逸出血管外；黏膜基底層和黏膜下層微靜脈管壁增厚，管腔明顯擴大，無炎癥細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組相比，PHG組PVP水平顯著增高［（16.02±2.78）mmHg vs（7.83±1.05）mmHg，P＜0.01］，PHG組GMBF也顯著增加［（10.36±8.30）m L/h vs（4.68±3.88）mL/h，P＜0.05］；PHG大鼠HO-1陽性細(xì)胞明顯增多，HO-1主要在胃黏膜固有層表達(dá)；HO-1蛋白的表達(dá)水平比假手術(shù)組亦明顯升高；胃黏膜HO-1蛋白表達(dá)量與GMBF呈正相關(guān)（r=0.564，P＜0.05）。結(jié)論HO-1在PHG大鼠中表達(dá)明顯增高，參與了PHG的發(fā)生。

高血壓，門靜脈；血紅素加氧酶-1；一氧化碳；大鼠

門靜脈高壓性胃病（portal hypertensive gastropathy，PHG）是肝硬化的常見并發(fā)癥，其產(chǎn)生機制尚不十分清楚，除門靜脈高壓（portal hypertension，PHT）外，可能與擴血管物質(zhì)增多而引起血管擴張有關(guān)［1］。一氧化碳（carbon monoxide，CO）是繼一氧化氮（nitric oxide，NO）之后又一新的細(xì)胞信使分子，生理作用類似NO，可介導(dǎo)多種病理、生理過程，它由血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）催化血紅素降解過程中產(chǎn)生，在細(xì)胞功能和通訊的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［2］。目前認(rèn)為NO參與了PHG的形成，而CO是否參與了PHG的發(fā)生，目前尚乏研究。本文通過對PHG大鼠胃組織HO-1的表達(dá)及血流動力學(xué)指標(biāo)的研究，旨在探討HO-1在PHG中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：純種、雄性、健康Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量250～300g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，醫(yī)動字第04057號。隨機分為2組，假手術(shù)組12只；PHG組16只。按清潔大鼠的要求飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，實驗前禁食24h，但不禁水。

1.2 PHG大鼠模型的制備：按照段進(jìn)東等［3］方法建立PHG模型，具體方法操作如下。鹽酸氯氨酮腹腔注射麻醉大鼠，給藥劑量為100mg/kg；無菌條件下做腹正中切口，暴露并游離門靜脈主干；PHG組沿其縱軸方向外置20G的鈍性針頭，于近肝門處用

3.0絲線結(jié)扎門靜脈主干及外置針頭后，拔出針頭，復(fù)位內(nèi)臟，逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組僅游離門靜脈主干，不結(jié)扎，余步驟同PHG組。手術(shù)2周后進(jìn)行各項指標(biāo)實驗測定。

1.3 實驗試劑與主要儀器：兔抗大鼠HO-1多克隆抗體為北京中山生物技術(shù)公司產(chǎn)品，兔SP試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司，中性紅購自上海試劑二廠。八道生理記錄儀購自中國成都，微量注射泵為德國產(chǎn)品，DYY-Ⅲ28C垂直電泳槽和DYY-Ⅲ40B垂直轉(zhuǎn)膜槽為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.4 門靜脈壓力（portal venous pressure，PVP）測定：大鼠禁食24h后，經(jīng)鹽酸氯胺酮腹腔麻醉后，腹正中切口進(jìn)入腹腔，分離門靜脈主干及回結(jié)腸靜脈，應(yīng)用一細(xì)塑料管經(jīng)回結(jié)腸靜脈插入門靜脈主干，另一端連接八道生理記錄儀，測量PVP。

1.5 胃黏膜血流量（gastric mucosal blood flow，GMBF）測定：沿左腹股溝切開皮膚及皮下組織，分離股動、靜脈，用一細(xì)塑料管插入股靜脈，接微量輸液泵，供輸注中性紅溶液用。同時經(jīng)十二指腸向胃插入另一細(xì)塑料管，收集胃液0.5m L，作為空白對照。然后從股靜脈注射中性紅（4mg/kg）2m L，約4min，再以恒速輸注維持量中性紅（4mg·kg-1· h-1），收集胃液，15min收集1次，共8次。實驗?zāi)┦占?mL。采用中性紅清除率方法測定GMBF［4］，測定收集的胃液和血液標(biāo)本中的中性紅濃度，計算胃黏膜對中性紅的清除率。計算公式，GMBF=單位時間胃液分泌量×胃液中性紅濃度/血液中性紅濃度。

1.6 形態(tài)學(xué)檢查：胃組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)制成石蠟切片，行蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察胃黏膜的形態(tài)學(xué)改變。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測：石蠟包埋的胃組織以5μm的厚度連續(xù)切片→二甲苯脫蠟，酒精梯度水化→3%H2O2室溫孵育30min→0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）抗原修復(fù)→10%正常山羊血清封閉→滴加特異性HO-1抗體，4℃過夜→滴加生物素化二抗→滴加1∶200稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素→二氨基聯(lián)苯胺-H2O2顯色→蘇木素復(fù)染→酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）代替一抗進(jìn)行上述染色作為空白對照，結(jié)果為陰性。棕褐色為陽性染色。

1.8 Western blot分析：①胃組織蛋白提取，取100mg胃體組織，用冰冷的PBS漂洗2次，置于勻漿管中，加入1mL改良的RIPA裂解緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；150mmol/L NaCl；1%多聚仙梨醇；0.5%脫氧膽酸鈉；0.1%SDS；1mmol/L乙二胺四乙酸；100mg/L PMSF；10mg/LLeupeptin；100mmol/L原釩酸鈉），制成勻漿，冰上靜置30min，4℃10 000g離心10min，取上清采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白含量。②SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和印跡，以150μg/孔上樣，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行凝膠分離，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在含5%脫脂奶粉的Tween20-Tris緩沖鹽溶液（tween20 tris buffered saline，TTBS）中37℃封閉過夜，加入兔抗大鼠HO-1抗體（1∶500），4℃孵育過夜，TTBS充分漂洗（10min×3次），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育2h，TTBS充分漂洗（10min×3次），ECL顯色后觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；兩參數(shù)之間關(guān)系采用直線相關(guān)回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PHG胃黏膜大體形態(tài)變化：沿胃大彎打開胃腔，若發(fā)現(xiàn)胃黏膜有散在的紅點和小瘀斑，即認(rèn)為黏膜損傷陽性；假手術(shù)組12例中僅1例黏膜損傷陽性，而PHG組18例中有10例黏膜損傷陽性，PHG大鼠胃黏膜損傷率明顯高于假手術(shù)組。見表1。

表1 2組大鼠胃黏膜損傷比較Table 1 Com parion of gastric mucosa injury between sham-operated and portal hypertensive rats

2.2 血流動力學(xué)指標(biāo)測定：①PHG大鼠PVP為（16.02±2.78）mmHg，假手術(shù)組為（7.83±1.05）mmHg，PHG大鼠組PVP明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。②PHG大鼠GMBF為（10.36±8.30）mL/h，假手術(shù)組為（4.68±3.88）mL/h，PHG大鼠組GMBF明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

2.3 胃組織學(xué)表現(xiàn)：光鏡下，可見PHG大鼠胃黏膜層毛細(xì)血管擴張，腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞，并有大量紅細(xì)胞逸出血管外；黏膜肌層和黏膜下層微靜脈管壁增厚，管腔明顯擴大；黏膜下層增厚，無炎癥細(xì)胞浸潤（圖1）。

圖1 假手術(shù)組和門脈高壓性胃病組大鼠的組織學(xué)變化（HE×100）A.假手術(shù)組；B.門脈高壓性胃病組Figure 1 Histopathological feature changes in gastricmucosa of shamoperated and portal hypertensive rats（HE×100）A.Sham operated group；B.PHG group

2.4 HO-1在胃組織中的免疫組織化學(xué)定位：正常大鼠胃組織中僅在黏膜層有少量表達(dá)，而在PHG大鼠HO-1陽性細(xì)胞明顯增多，主要在黏膜固有層表達(dá)。PHG大鼠胃組織HO-1的陽性面積（45.60±9.17）%顯著高于假手術(shù)組（11.70± 3.89）%（P＜0.05），見圖2。

圖2 HO-1在假手術(shù)組和門脈高壓性胃病組大鼠的組織中的免疫組織化學(xué)表達(dá)（DAB×100）A.假手術(shù)組；B.門脈高壓性胃病組Figure 2 The expression of HO-1 in gastric mucosa from shamoperated and portal hypertensive rats by immunohistochemistry（DAB× 100）A.Sham operated group；B.PHG group

2.5 HO-1在胃組織中的表達(dá)：從雜交信號的強度便知，PHG組HO-1的蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，見圖3。

圖3 HO-1在假手術(shù)組和門脈高壓性胃病組大鼠的組織中的蛋白表達(dá)Control：假手術(shù)組；PHG：門脈高壓性胃病組Figure 3 The expression of HO-1 protein in sham-operated and portal hypertensive ratsControl：Sham operated group；PHG：PHG group

2.6 胃黏膜HO-1表達(dá)量與胃黏膜血流量的相關(guān)性：通過相關(guān)回歸發(fā)現(xiàn)HO-1與GMBF呈顯著性正相關(guān)（r=0.564，P＜0.05），直線回歸方程為y= 0.008 7x+0.363 7。表明隨著HO-1蛋白表達(dá)增加，GMBF增高亦愈明顯。

3 討 論

CO是繼NO之后又一重要的第二信使介質(zhì)，參與神經(jīng)沖動的傳遞、松弛血管平滑肌及阻止血小板聚集等生理作用［5］。內(nèi)源性CO有2種來源：一種為有機物的氧化（如生物膜的脂質(zhì)過氧化）；另一種為血紅素的生理降解，此為CO的主要來源。血紅素在HO的作用下，生成等摩爾數(shù)的CO、Fe和膽綠素，后者很快還原為膽紅素。HO是微粒體酶，已發(fā)現(xiàn)有HO-1、HO-2和HO-3三種亞型。HO-1為誘導(dǎo)型，是在缺氧、內(nèi)毒素、NO、腫瘤壞死因子［6］等作用下產(chǎn)生；HO-2為結(jié)構(gòu)型，主要分布在腦組織及肝臟中，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及維持肝竇的低張力狀態(tài)；HO-3功能尚不清楚。

Godn等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟受到損傷時，HO-1表達(dá)明顯增多，同時CO濃度也升高。已有研究證實CO是肝竇的主要生理調(diào)節(jié)介質(zhì)，為一內(nèi)源性舒張因子，能明顯降低肝竇的緊張度，對維持肝臟血流發(fā)揮重要作用［8］。有研究［9］表明，在PHT動物模型中，小腸、腸系膜及大腸等組織HO-1也呈高表達(dá)，導(dǎo)致其下游產(chǎn)物CO生成增加，在PHT高血流動力學(xué)紊亂中起著一定作用。而應(yīng)用HO-1的抑制劑N-乙酰半胱氨酸抑制CO的合成，可以防止肝硬化門靜脈高壓高動力循環(huán)狀態(tài)的發(fā)生［10］。因此，CO具有明顯擴張血管的作用。本研究結(jié)果顯示，PHG大鼠黏膜層毛細(xì)血管明顯擴張，且PVP、GMBF水平同時升高，表明PHG存在高灌注狀態(tài)。免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果顯示，HO-1在PHG大鼠中表達(dá)明顯增高。HO-1的表達(dá)升高，導(dǎo)致其下游產(chǎn)物CO生成增多，CO可以直接引起胃黏膜血管擴張，而且增多的CO可使血管對收縮物質(zhì)敏感性下降，抑制了后者收縮血管的作用。因此，作為血管擴張劑的CO能夠部分解釋PHG胃黏膜和黏膜下血管擴張這種形態(tài)學(xué)和血流動力學(xué)的改變。

本研究還顯示，GMBF與HO-1的表達(dá)量呈明顯正相關(guān)，支持胃黏膜組織HO-1增加有可能導(dǎo)致GMBF增多和紊亂的觀點。同時由于PHG胃組織動靜脈交通支開放，GMBF增加，黏膜處于缺氧狀態(tài)，使HO-1蛋白表達(dá)升高，CO生成增多，后者使血管擴張，PHG加重，形成一種惡性循環(huán)狀態(tài)。因此，CO促進(jìn)了PHG的發(fā)展。

CO的作用機制基本同NO，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷升高，產(chǎn)生平滑肌松弛等生理效應(yīng)［9］；此外還可通過調(diào)節(jié)K+通道的活性傳遞生理信息。CO過量產(chǎn)生的原因尚不清楚，可能由于PHG時，NO升高［11］、缺氧等刺激使HO-1表達(dá)升高，其下游產(chǎn)物CO可能相應(yīng)增加，當(dāng)然關(guān)于CO的確切作用還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF HEM E OXYGENASE-1 IN PORTAL HYPERTENSIVE GASTROPATHY RATS

LU Xinqing1，LIU Zhijun1，LIGuiying1，LIXiaotian1，JIANG Huiqing2*
（1.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China；
2.Department of Gastroenterology，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the expression of heme oxygenase-1（HO-1）in gastric mucosa from sham-operated and portal hypertensive rats and the possible role of carbon monoxide（CO）in portal hypertensive gastropathy（PHG）.MethodsThe Sprague Dawley rats were randomly divided into two groups，sham operation and model group（PHG）.Fourteen days after a portal ligation or sham operation，the portal venous pressure was measured with physiology recorder，and the gastric mucosal blood flow volume wasmeasured with the neutral red clearance method.Histopathological changes were evaluated by hematoxylin and eosin staining，the expression of HO-1 in gastric mucosal specimens was immunohistochemically assessed，and expression ofHO-1 protein was assessed by Western blotanalysis. Results Fourteen days after the surgery，morphology studies showed a number ofmucosal capillaries and submucosal veins were dilated markedly without any inflammation.The portal pressure（16.02±2.78）mmHg in the PHG rats was significantly greater than that in the control rats（7.83±1.05）mmHg（P＜0.01）.Gastric mucosal blood flow（GMBF）（10.36±8.30）mL/h in the PHG rats was significantly greater than that in the control rats（4.68±3.88）mL/h（P＜0.05）.On the 14th day，the level of HO-1 protein in gastric organswas significantly higher in PHG than that in sham-operated animals. The expression of HO-1 protein in PHG group had a positive correlation with GMBF（r=0.564，P＜0.05）.ConclusionHO-1 is up-regulated in the gastricmucosal areas in PHG rats，whichmay play a role in PHG.

hypertension，portal；heme oxygenase-1；carbonmonoxide；rats

R657.34

A

1007-3205（2012）08-0877-04

2012-02-21；

2012-05-19

河北省自然科學(xué)基金項目（303483）

路新卿（1975-），男，河北館陶人，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事消化內(nèi)科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：huiqingjiang@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.004