VEGF、MMP-7在乳腺導管原位癌、浸潤性導管癌中的表達及相互關系

張 偉，張飛燕，李 芳，李 璐，安慧琴

（1.河北省保定市第二醫院病理科，河北保定 071051；2.河北大學附屬醫院麻醉科，

河北保定 071000；3.河北省人民醫院耳鼻喉科，河北石家莊 050051）

VEGF、MMP-7在乳腺導管原位癌、浸潤性導管癌中的表達及相互關系

張 偉1，張飛燕1，李 芳1，李 璐2，安慧琴3

（1.河北省保定市第二醫院病理科，河北保定 071051；2.河北大學附屬醫院麻醉科，

河北保定 071000；3.河北省人民醫院耳鼻喉科，河北石家莊 050051）

目的探討轉移相關蛋白血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶-7（matrixmetallo proteinases-7，MMP-7）在乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌中的表達及相互關系。方法采用免疫組織化學SP法檢測導管原位癌25例、乳腺浸潤性導管癌68例和正常乳腺組織17例中VEGF和MMP-7的表達，并進行相關分析。結果VEGF、MMP-7在乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌中的表達分別為92.00%、88.24%和84.00%、83.82%，顯著高于正常乳腺組織的表達47.06%、52.94%（P＜0.01）。VEGF、MMP-7的表達與乳腺癌的腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有關（P＜0.05）。結論VEGF和MMP-7與乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌的發生發展相關，并具有協同作用。

乳腺腫瘤；血管內皮生長因子A；基質金屬蛋白酶7

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前所知作用最強的一種促血管生長因子，能通過促進血管內皮增殖、增加血管通透性、促進血管支持物的生成及抑制腫瘤細胞凋亡參與腫瘤的生長和浸潤、轉移。大量研究［1-3］發現在胃癌、大腸癌、上皮性卵巢癌等VEGF表達均明顯升高?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是依賴Zn2+降解細胞外基底膜基質的的一類蛋白水解酶，MMP-7是其中相對分子質量最小的成員，主要在各種腫瘤細胞上表達，具有高度的蛋白溶解能力及廣泛的底物特異性，它可以通過滅活α-抗胰蛋白酶，間接激活MMPs自身，降解Ⅳ型膠原、蛋白聚糖、酪蛋白、層黏連蛋白，纖黏連蛋白［4］，從而協助腫瘤細胞穿透基底膜向周圍組織浸潤、轉移。本研究采用鏈菌素親生物素——過氧化酶連接法（streptavidin peroxidase conjugated method，SP）免疫組織化學染色技術，檢測VEGF和MMP-7在乳腺浸潤性導管癌及正常乳腺組織中的表達，分析VEGF和MMP-7與乳腺癌浸潤的關系，以求為浸潤性乳腺癌的預測提供相關理論資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本試驗采用河北省保定市第二醫院病理科2006—2011年乳腺浸潤性導管癌外科手術石蠟包埋標本68例，導管原位癌25例，術前未經過任何治療，隨機選取非癌乳腺組織17例標本作為對照組。所有乳腺癌標本均有完整的臨床病理資料。乳腺癌臨床病理資料的收集包括患者的年齡、腫瘤的大小、病理組織學分級（按Broder的宮頸癌分類標準分級［1］）、臨床分期、淋巴結轉移情況等按照WHO乳腺腫瘤組織學分類（2003版）［5］標準進行，并經3位有經驗的病理醫師采取雙盲法對全部切片進行組織學分型復診。

1.2 免疫組織化學染色方法：將全部石蠟包埋的組織塊，制成組織芯片3個，制成切片，用于免疫組織化學染色（應用SP法進行檢測），采用MMP-7單克隆抗體（兔抗人）、MMP-7工作液濃度為1∶100，VEGF單克隆抗體（兔抗人）、VEGF工作液濃度為1∶100，試劑均購于福州邁新生物技術開發公司。

1.3 結果判斷：VEGF和MMP-7細胞漿均勻染有棕色或棕黃色顆粒，染色強度高于背景非特異性染色者為陽性細胞。每張切片選取5個高倍鏡視野，每個高倍視野下分別隨機計數100個腫瘤細胞，并計算出陽性表達的腫瘤細胞所占的百分比，然后求出5個高倍視野下陽性細胞數。陽性表達以陽性細胞所占比例進行計數，幾乎未見陽性細胞為陰性（-），著色欠佳者為可疑陽性（±），陽性細胞數0%～25%為弱陽性（+），＞25%～75%者為陽性（++）。

1.4 統計學方法：應用SPSS10.0軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，相關性采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF在乳腺組織中的表達：VEGF的陽性染色物質主要定位于細胞胞漿中，呈棕黃色顆粒狀。VEGF在正常乳腺組織（圖1A）、導管原位癌（圖1B）及浸潤性導管癌（圖1C）中陽性表達例數分別為8、23、60例，陽性表達率分別為47.06%、92.00%和88.24%，其中強陽性表達率分別為0.00%、40.00%和38.24%。乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌中VEGF的表達均明顯高于正常乳腺組織（χ2=18.78，P＜0.05），而2組間差異無統計學意義（P＞0.05）。VEGF在中～低分化乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于高分化組。見表1。

表1 血管內皮生長因子在不同組別的表達Table 1 Expression of VEGF in different groups

2.2 MMP-7在乳腺組織中的表達：MMP-7的免疫反應產物呈棕黃色顆粒狀，主要定位于乳腺浸潤性導管癌癌細胞胞漿中，在癌旁的正常乳腺組織、基質中成纖維細胞、血管內皮細胞及中性白細胞中也有表達。MMP-7在正常乳腺組織（圖2A）、導管原位癌（圖2B）及浸潤性導管癌（圖2C）陽性表達例數分別為9、21、57例，陽性表達率分別為52.94%、84.00%和83.82%，其中強陽性表達率分別為0.00%、56.00%和77.94%。乳腺導管原位癌和導管浸潤癌中VEGF的表達均明顯高于正常乳腺組織（χ2=28.99，P＜0.05），而2組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 基質金屬蛋白酶-7在不同組別的表達Table 2 Expression of MMP-7 in different groups

2.3 VEGF和MMP-7表達與乳腺癌臨床病理特征的關系：中～低分化乳腺癌VEGF和MMP-7陽性表達率明顯高于高分化（P＜0.05）；臨床分期Ⅱ～Ⅲ期VEGF和MMP-7陽性表達呈明顯高于0～Ⅰ期（P＜0.05）；有淋巴結轉移VEGF和MMP-7陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移（P＜0.05或 P＜0.01）；2種蛋白在乳腺癌中的表達與患者年齡及腫瘤大小無關（P＞0.05）。見表3。

2.4 乳腺癌組織中VEGF和MMP-7蛋白表達的關系：VEGF與MMP-7存在明顯的正相關關系（rs=0.414，P＜0.05）。

表3 VEGF和MMP-7的表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系Table 3 Ralationship between VEGF，MMP-7 expression and clinicopathological features in breast carcinoma

3 討 論

乳腺癌的轉移是一個多基因參與、多步驟完成的復雜過程，其中涉及腫瘤細胞自身生長優勢的獲得、細胞間黏附能力的降低、癌細胞對細胞外基質（extracellularmatrixc，ECM）和基底膜的降解與破壞、細胞骨架重構引起細胞運動與遷移、細胞因子誘導的癌細胞器官特異性定向歸巢、腫瘤血管和淋巴管生成、癌細胞逃逸凋亡和免疫殺傷等諸多因素。這些因素是互相關聯和相互影響且受乳腺癌轉移相關基因的調控。

腫瘤生長是血管依賴性的，腫瘤從靜止狀態發展到伴隨腫瘤血管新生的浸潤狀態，其關鍵環節在于血管生成刺激因子與抑制因子間平衡狀態的改變。VEGF蛋白是一種肝素結合因子，由腫瘤細胞、巨噬細胞及纖維母細胞等分泌，廣泛分布于人和動物體內的大腦、腎臟、肝臟、脾臟、胰腺和骨骼等組織中。VEGF是由2條N端相同而其他區域存在某些差異的多肽鏈通過二硫鍵連接而成的高度保守糖蛋白二聚體，相對分子質量為34 000～42 000。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子。

在病理情況下，VEGF可出現異常表達，如缺血性疾病中，缺氧可刺激VEGF表達上調，通過對內皮細胞強烈的促有絲分裂作用，促進新生血管形成，改善組織供血。在腫瘤組織中，腫瘤細胞、腫瘤侵入的巨嗜細胞和肥大細胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內皮細胞，促進內皮細胞增殖、遷移，誘導血管形成，促進腫瘤持續生長，并提高血管通透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進單核細胞、成纖維細胞內皮細胞浸潤，有利于腫瘤基質形成和腫瘤細胞進入新生血管，促進腫瘤轉移［6］。

乳腺癌的生長和轉移是一個復雜過程，其中腫瘤血管的生成起著重要的作用，并直接與乳腺癌的生長、浸潤及轉移有關。VEGF能促進腫瘤血管的形成；VEGF的過表達使腫瘤血管生成增多，保證了腫瘤細胞能得到更多的營養，加快了腫瘤細胞的增殖，從而促進癌細胞的浸潤和轉移［7］；晚期乳腺癌患者VEGF陽性表達明顯高于早期乳腺癌患者，VEGF陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移有直接的關系，提示VEGF不但可作為判斷乳腺癌轉移的一個腫瘤標記物，還可以作為判斷乳腺癌的預后指標。VEGF與乳腺癌的浸潤轉移和預后判斷等多方面有著緊密聯系，VEGF陽性表達率和表達量都明顯高于正常乳腺組織，有淋巴結轉移和組織分級較高的乳腺癌組織中陽性表達率和表達量都明顯升高［8］。VEGF表達與乳腺癌的侵襲和進展密切相關，VEGF表達增高是乳腺癌侵襲和轉移的重要生物學標志［9］。本研究顯示，乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌中VEGF表達陽性率明顯高于正常乳腺組織，且與乳腺癌的分化程度、臨床分期密切相關，表明VEGF可能參與了乳腺癌的發生和演化進展過程。同時本研究顯示有淋巴結轉移乳腺癌VEGF表達水平顯著高于無淋巴結轉移，提示癌細胞可能是通過產生VEGF促進微血管形成而使其容易完成淋巴結轉移。血管生成是腫瘤體積增加的基礎，同時血管增多及通透性增強也增加了腫瘤細胞進入血管的機會，從而使腫瘤細胞容易通過靜脈、淋巴管吻合處從血液循環中進入淋巴管，所以腫瘤淋巴結轉移的幾率隨著血液循環中腫瘤細胞的增加而增高，因此，腫瘤血管生成對淋巴結轉移具有間接促進作用。

目前發現的MMPs有20余種，主要由5個亞類組成：①Ⅰ型膠原酶，MMP-1、MMP-8、MMP-13，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；②明膠酶類，MMP-2、MMP-9，降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原，彈性蛋白，纖維連接蛋白，層黏蛋白；③基質溶解素類，MMP-3、MMP-7、MMP-11、間質溶酶MMP-7、彈性蛋白酶MMP-12，降解彈性蛋白、纖維連接蛋白、層黏蛋白、α2抗胰蛋白酶等；④膜型MMPs，包括MT-MMP1、MT-MMP2、MT-MMP3、MT-MMP4；⑤其他類型MMPs，MMP-19、MMP-23?；蚨ㄎ淮蠖鄶滴挥?1q22。

所有MMPs具有相似的結構特點，由功能各不相同的3部分組成即氨基酸的信號肽和前肽部分，中間的催化活性區域和羧基端的類血紅素結合蛋白區基質金屬蛋白酶在腫瘤浸潤、轉移中的作用可概括為：①破壞局部組織結構，利于腫瘤生長；②破壞基底膜屏障，利于腫瘤轉移；③通過對細胞外基質的改建，促進腫瘤新生血管形成；④調節細胞黏附；⑤促血管生成作用。

MMP-7由于缺乏與血紅素結構蛋白同源序列而成為MMPs家族中最小成員，基因位于11q21q22，cDNA全長1 094bp，其作用底物主要是基質中的蛋白多糖和糖蛋白。MMP-7由腫瘤細胞產生且能活化其他MMPs成員如MMP-2、MMP-9及滅活Serpins（絲氨酸蛋白酶抑制劑）。而MMP-2的主要底物是Ⅳ型膠原，主要作用是能分解基底膜中的纖維連接蛋白和層黏連蛋白，因此MMP-7在腫瘤細胞突破基底膜屏障而浸潤轉移中起重要作用。本研究顯示，乳腺浸潤性導管癌中MMP-7的陽性表達率明顯高于正常乳腺組織。曹蕾等［10］也有結果證明，MMP-7蛋白在乳腺癌中的陽性表達率和表達量均高于正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤和乳腺增生性病變。且乳腺癌中MMP-7的表達水平與乳腺癌病理組織學分級、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，這一結果在康穎等［11］的研究中也得到相同的結論。本研究提示MMP-7不僅可能參與了乳腺癌的發生和發展，同時也參與了乳腺癌的轉移過程。

目前研究發現VEGF與MMP-7在一些腫瘤的血管生成及浸潤轉移過程中具有某種內在聯系。Hashimoto等［12］研究表明，MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13能加工結締組織生長因子，使之不能與VEGF受體結合，從而間接釋放VEGF，促進血管形成。Mit Siades等［13］認為MMP-7能降解細胞膜上的Fas配體，抑制Fas介導的細胞凋亡，促進腫瘤細胞的生長，可能間接促進了腫瘤細胞分泌VEGF。提示VEGF和MMP-7在腫瘤惡性生物學行為中可能有內在聯系，共同促進惡性腫瘤的血管形成與向遠處侵襲轉移。本研究顯示，VEGF與MMP-7之間具有相關關系，但尚不能認為2個指標在乳腺癌的檢出上差異有統計學意義，因此有關VEGF與MMP-7在乳腺癌發生、發展中的作用與聯系還需要進一步探討。

VEGF和MMP-7在乳腺癌中的表達規律及其與腫瘤侵襲、轉移行為間的關系，可為乳腺癌的預后估計及靶向治療開辟一條新的途徑。VEGF本身在血管形成中的作用已較清楚，與MMP之間的密切關系及相互作用的具體機制有待進一步研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

RELATIONSHIP OF VEGF AND MMP-7 PROTEINS EXPRESSED IN BREAST DUCTAL CARCINOMA IN SITU AND INFILTRATING DUCTAL CARCINOMA

ZHANGWei1，ZHANG Feiyan1，LIFang1，LILu2，AN Huiqin3
（1.Depertment of Pathology，the Second Hospital of Baoding City，Hebei Province，Baoding 071051，China；
2.Depertmentof Anesthesiology，the Affiliated Hospital of HebeiUniversity，Baoding 071000，China；
3.Depertmentof Otolaryngology，the People′sHospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo investigate the expression and relationship of vascular endothelial growth factor（VEGF）andmatrixmetalloproteinases-7（MMP-7）proteins in breastductal carcinoma in situ and infiltrating ductal carcinoma.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of VEGF and MMP-7 proteins in 25 breast ductal carcinoma in situ，68 breast infiltrating ductal carcinoma tissues and 17 normal breast tissue.ResultsThe positive rates of VEGF and MMP-7 in breast ductal carcinoma in situ and breast infiltrating ductal carcinoma tissues were（92.00%，88.24%）and（84.00%，83.82%），respectively.They were significantly higher than those in normal group（47.06%and 52.94%，P＜0.05）.The expression of VEGF and MMP-7 was significantly correlated with differentiation，TNM stage and lymph node metastasis（P＜0.05）.ConclusionVEGF and MMP-7 may all be involved in the carcinogenesis and progression of breast ductal carcinoma.And they maybe play a synergetic role in the process of breast infiltrating ductal carcinoma.

breast neoplasms；vascular endothelial growth factor A；matrix metalloproteinases7

R737.9

A

1007-3205（2012）08-0914-05

2012-02-22；

2012-04-26

張偉（1971-），女，河北平鄉人，河北省保定市第二醫院副主任醫師，醫學學士，從事臨床病理診斷研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.016