細胞色素P4501B1在子宮內膜癌組織中的表達與ER相關

王 瑾，笪紀平，徐培培，李雪靜，程建新，李 利*

（1.河北醫科大學第四醫院婦科，河北石家莊 050011；2.中日友好醫院病理科，北京 100029）

·論 著·

細胞色素P4501B1在子宮內膜癌組織中的表達與ER相關

王 瑾1，笪紀平2，徐培培1，李雪靜1，程建新1，李 利1*

（1.河北醫科大學第四醫院婦科，河北石家莊 050011；2.中日友好醫院病理科，北京 100029）

目的檢測子宮內膜癌及正常子宮內膜中細胞色素P4501B1（cytochrome P450 1B1，CYP1B1）、兒茶酚氧位甲基轉移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）的表達差異，探討其在子宮內膜癌發生發展過程中的意義。方法采用免疫組織化學SP法對40例子宮內膜癌及35例正常子宮內膜組織切片進行染色，使用奧林巴斯公司DP70成像系統完成采圖，應用Image-Pro Plus5.1圖像分析系統對染色標本進行圖像分析處理。結果子宮內膜癌組織腺上皮胞漿中CYP1B1的表達明顯高于正常子宮內膜組織（P＜0.05）；而COMT的表達低于正常子宮內膜組織（P＜0.05）。子宮內膜癌組織中CYP1B1表達隨雌激素受體表達增強而增強（P＜0.05）。CYP1B1與COMT表達在正常子宮內膜組織中存在正直線相關關系（r=0.384，P＜0.05）。結論CYP1B1在子宮內膜癌的發生過程中起重要的作用，其作用發揮依賴雌激素受體，而COMT起保護性作用。此2種酶共同維持機體內正常的雌激素代謝，防止過多致癌物的產生。

子宮內膜腫瘤；細胞色素P450酶系統；受體，雌激素

子宮內膜癌（endometrial carcinoma）為女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，約占女性癌瘤的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20% ～30%［1］。近年隨著全球婦女人均壽命的延長，雌激素替代療法的日益增多，其發病率已呈上升趨勢。據統計［2］，美國每年約有35 000例新病例，6 500例死于該病。我國雖缺乏大規模的統計學資料，但其上升趨勢已顯而易見。子宮內膜癌和子宮頸癌的發病率已從20世紀60年代的1∶10變為現今的1∶1［3］。雖然目前子宮內膜癌的病因學研究備受關注，但此病發生機制尚未明確。國際上已有較多的研究資料［4］表明雌激素及其代謝產物兒茶酚雌激素，可引起機體DNA的突變，從而誘發癌癥的發生。而雌二醇相關的細胞內代謝主要包括細胞色素P4501B1（cytochrome P450 1B1，CYP1B1）介導的氧化作用（主要為羥化）以及 兒 茶 酚 甲 基 轉 移 酶（catechol-O -methyltransferase，COMT）介導的氧位甲基化作用。我們推測這二種酶可能與雌激素依賴性子宮內膜癌的發生發展有關。本研究通過免疫組織化學方法檢測CYP1B1和COMT在子宮內膜癌以及正常子宮內膜中的定位及表達，旨在為子宮內膜癌的早期診治及抗癌藥物的研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2007年6月—2008年6月河北醫科大學第四醫院婦科經手術治療，術后病理確診為子宮內膜癌的患者40例，年齡36～70歲，平均（53.00±10.42）歲，根據手術-病理分期，Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期13例；病理分級，1級（高分化）13例，2級（中分化）15例，3級（低分化）12例；淺肌層浸潤26例，深肌層浸潤13例，無肌層浸潤1例。術后病理顯示，雌激素受體（estrogen receptor，ER）（-）9例，ER（ +～++）24例，ER

（+++）7例；孕激素受體（progesterone receptor，PR）（-）8例，PR（+～++）25例，PR（+++）7例；p53（-）21例，p53（+）19例。同期收治35例子宮頸癌患者的正常子宮內膜作為對照組，臨床和病理排除子宮肌瘤、子宮內膜異位癥、子宮內膜增生、乳腺癌、卵巢癌等。年齡 36～72歲，平均（52.59±8.03）歲，均無腫瘤和遺傳病史。所選病例術前均無放化療病史，無激素替代治療史，無吸煙史，年齡之間差異無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：兔抗人 CYP1B1抗體（英國ABCAM公司）、兔抗人COMT抗體（美國SANTA CRUz公司）、辣根過氧化物酶標記抗兔/小鼠IgG多聚體（美國GIB公司）、DAB顯色劑（丹麥DAKO公司）。

1.2.2 研究方法：免疫組織化學SP法。所有標本均由10%甲醛固定，常規制作3μm厚連續石蠟切片，脫蠟水化，高壓修復，染色。

1.2.3 結果判斷標準：CYP1B1、COMT在正常子宮內膜及癌組織腺上皮細胞質表達，腺上皮細胞胞質內可見棕黃色顆粒，以細胞兩極表達明顯。應用OLYMPUS BX51顯微鏡及DP70成像系統進行采圖，Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件對免疫組織化學染色標本進行計量分析，對每張切片的平均光密度值進行統計學分析，以5個視野的均值作為該切片的最終平均光密度值，平均光密度值相當于陽性區域顏色的平均深淺程度，與著色強度呈正直線相關關系；ER、PR的陽性表達為細胞核呈棕褐色，P53陽性表達亦為細胞核呈棕褐色，每例均隨機觀察5個高倍視野（10×40），用半定量積分法判斷結果，陽性細胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；陽性強度黃色為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0分為陰性（ -），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.3 統計學方法：應用SPSS13.0版軟件包進行數據分析，計量資料以±s表示，兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，多個獨立樣本均數的比較采用單因素方差分析，相關性采用 Pearson直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CYP1B1和COMT在子宮內膜癌組織中的表達：CYP1B1、COMT主要在癌組織和正常內膜組織的腺上皮細胞胞漿著色，呈棕黃色，主要分布在細胞兩級，表達較為均一（圖1）。子宮內膜癌組織腺上皮胞漿中CYP1B1平均光密度值明顯高于正常子宮內膜組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。COMT在內膜癌組織中的平均光密度低于正常子宮內膜組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 CYP1B1和COMT在不同手術-病理分期表達：分期越晚，CYP1B1平均光密度越高，早期表達明顯低于晚期，差異有統計學意義（P＜0.05）。分期越晚，COMT平均光密度越低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 CYP1B1和COMT表達與ER、PR、p53的關系：在ER（-）、ER（+～++）、ER（+++）3組中，隨ER表達逐漸升高，CYP1B1平表達呈逐漸升高趨勢，且差異有統計學意義（P＜0.05）；COMT在3組中表達差異無統計學意義。在 PR（ -）、PR（+～++）、PR（+++）3組中，此2種酶表達差異無統計學意義。p53（-）、p53（+）2組中COMT表達差異有統計學意義。見表3，4。

2.4 CYP1B1與COMT的相關性分析：正常子宮內膜組織中CYP1B1與COMT表達存在正直線相關關系（r=0.384，P=0.025）；而內膜癌組織中此2種酶不存在相關性。

表1 病例組與對照組CYP1B1、COMT表達比較Table 1 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases and controls（±s）

表1 病例組與對照組CYP1B1、COMT表達比較Table 1 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases and controls（±s）

*P＜0.05 vs control by t testCYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n CYP1B1 COMT Control 35 0.169±0.184 0.290±0.052 Case 40 0.259±0.044* 0.208±0.058*

表2 病例組不同期別CYP1B1、COMT表達比較Table 2 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases of different stages（±s）

表2 病例組不同期別CYP1B1、COMT表達比較Table 2 Comparison of CYP1B1，COMT expression levels in cases of different stages（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n 13 0.236±0.038 0.234±0.056Ⅱ14 0.259±0.044 0.207±0.057Ⅲ～Ⅳ 13 0.282±0.039 0.182±0.057 F CYP1B1 COMTⅠ0.027 0.113 3.980 0.363 P

表3 CYP1B1、COMT表達與ER的關系Table 3 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and ER expression（±s）

表3 CYP1B1、COMT表達與ER的關系Table 3 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and ER expression（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol - O -methyltransferase；ER：estrogen receptor

Groups nCYP1B1 COMT ER（-）9 0.245±0.053 0.206±0.067 ER（+～++） 24 0.252±0.037 0.212±0.060 ER（+++） 7 0.301±0.031 0.197±0.047 F 0.016 0.842 4.637 0.177 P

表4 CYP1B1、COMT表達與p53的關系Table 4 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and p53 expression（±s）

表4 CYP1B1、COMT表達與p53的關系Table 4 Comparison of CYP1B1，COMT expressions and p53 expression（±s）

CYP1B1：cytochrome P450 1B1；COMT：catechol-O-methyltransferase

Groups n CYP1B1 COMT p53（-）21 0.254±0.039 0.227±0.063 p53（+） 19 0.264±0.049 0.188±0.048 t 0.490 0.035 0.697 2.184 P

3 討 論

CYP1B1是已知的細胞色素P450超基因家族成員之一，為 CYP1B亞族的惟一成員［5］，與其他P450酶的不同之處在于其在正常組織中不出現或表達水平很低，但在多種腫瘤組織中表達過量。CYP1B1主要催化激活 17β-雌二醇（17βestradiol，E2）在C4位點羥化作用，主要的代謝產物4-羥雌二醇（4-OH-E2）發生以下2種反應：一方面在細胞內經氧化作用形成高活性的雌二醇-3，4-醌（E2-3，4-quinone），與DNA中的嘌呤反應形成去嘌呤加合物，DNA由此產生的無嘌呤位點發生突變，最終導致癌癥的發生；另一方面4-OHE2在COMT的甲基化作用下生成可溶于水的代謝產物，失去生物學活性排除體外。

本研究發現CYP1B1在癌組織中的表達強于正常內膜組織，與Saini等［6］的研究結論一致。李利等［7］采用Western blot方法研究發現CYP1B1在正常子宮內膜及癌組織中均有表達，并且發現癌組織中CYP1B1的表達量高于正常子宮內膜組織。因此，我們推測CYP1B1在子宮內膜癌發病機制中起著至關重要的作用。同時CYP1B1在腫瘤中特異性高表達，使用抑制劑對其活性進行抑制，可能成為子宮內膜癌治療的新靶點。目前研究報道的CYP1B1抑制劑主要有黃酮類化合物、芳烴類化合物、天然香豆素類化合物、天然芪及其類似物［8］。Ware等［9］研究發現，在腫瘤組織中特異性高表達的CYP1B1能介導熒光腫瘤標記物，然后通過顯影技術或光動力學療法對腫瘤進行診斷、治療和手術定位。

本研究發現隨子宮內膜癌手術-病理分期越晚，CYP1B1表達越強，其中晚期表達明顯強于早期，提示CYP1Bl可能為判定子宮內膜癌的預后指標。本研究發現隨著ER表達逐漸增強，CYP1B1也呈現出表達量逐漸升高趨勢。Tsuchiya等［10］研究發現E2調節CYP1B1表達，主要是因為E2可以誘導ER陽性細胞的表達，通過ER對CYP1B1基因發生作用，研究者首次證實了CYP1B1可以被雌激素激活；同時通過染色質免疫和凝膠移位分析顯示在CYP1B1基因的啟動子區域存在一種雌激素效應元件，ER與這種雌激素效應元件結合后調節E2代謝；利用免疫組織化學法研究CYP1B1與E2的關系提出子宮內膜增生期腺上皮CYP1B1為強表達，染色最深；在分泌期早期為中等強度表達；隨著月經周期進入分泌期其表達消失。可見CYP1B1在不同月經周期腺上皮的表達隨雌激素水平的變化而變化。CYP1B1與ER在共同參與雌激素代謝方面可能存在密切關系，雌激素水平升高誘導ER產生，激發雌激素效應原件，啟動 CYP1B1基因的轉錄合成CYP1B1蛋白，進而減低雌激素水平。因此，CYP1B1在子宮內膜癌組織中的表達與ER相關。

COMT是在機體各組織中廣泛存在的甲基化酶，是具有生物活性和（或）毒性的兒茶酚胺類化合物（如左旋多巴、兒茶酚類固醇、去甲腎上腺素等）的主要代謝酶，COMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基團轉移到兒茶酚胺類化合物的3位羥基上，生成可溶于水的代謝產物排出體外，這就避免了DNA的損傷［11］。

本研究結果顯示COMT在正常內膜組織表達明顯增強，而在癌組織中弱表達或不表達，我們推測COMT對子宮內膜癌發生發展起到保護性作用。同時本研究發現根據術后病理分期p53陰性組的子宮內膜癌組織COMT表達程度高于p53陽性組的子宮內膜癌組織。p53基因是研究最廣泛的與人類腫瘤的發生發展密切相關的腫瘤抑制基因之一。在正常組織中不能測出，當細胞DNA損傷發生腫瘤時，p53基因突變聚集，突變失活的p53蛋白導致細胞周期阻滯、誘導凋亡和DNA修復等功能喪失，失去控制細胞增殖和誘導細胞凋亡的能力而促使腫瘤生長，刺激微血管的增生促進腫瘤的侵襲和轉移［12］。

本研究顯示，正常內膜組織中，CYP1B1與COMT存在正的直線相關性，即隨著CYP1B1表達量逐漸增加，COMT表達有隨之升高的趨勢。因此，我們推測CYP1B1與COMT在正常子宮內膜中作用協調，保持著雌激素代謝產物的平衡，防止癌癥的發生。但內膜癌組織中未發現CYP1B1與COMT存在直線相關關系，二者的失衡在子宮內膜癌的發生中可能占據重要位置。

近年來，CYP1B1和COMT是被關注較多的2種酶，它們在雌激素代謝過程中起到的作用與子宮內膜癌的發生發展及治療密切相關。本研究所選病例的病理類型均為子宮內膜樣腺癌，因此這2種酶是否在子宮內膜癌的其他分型中起著重要作用有待進一步研究。充分了解它們的作用機制可以為子宮內膜癌的靶向性干預和治療給予明確的指導。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF CYTOCHROME P4501B1 IN HUMAN ENDOMETRIAL CANCER AND ITS ASSOCIATION WITH ER EXPRESSION

WANG Jin1，DA Jiping2，XU Peipei1，LI Xuejing1，CHENG Jianxin1，LI Li1*
（1Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospita of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pathology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

ObjectiveTo detect the expression of cytochrome P4501B1（CYP1B1）and catechol-O-methyltransferase（COMT）in endometrial cancer and normal endometrium，and to explore their significance in occurrence and development of endometrial cancer.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of CYP1B1 and COMT in 40 cases of endometrial cancer and 35 cases of normal endometrium.Olympus DP70 imaging system was used to collect image.Image-Pro Plus5.1 image analysis system was applied on the stained specimens for image analysis.ResultsThe expression of CYP1B1 was higher in endometrial cancer tissue than that in normal endometrium（P＜0.05），while the expression of COMT in endometrial cancer tissue was lower than that normal endometrium（P＜0.05）.The expression of CYP1B1 in endometrial cancer became stronger with the increasing of estrogen receptor（ER）expression（P＜0.05）.The expression of CYP1B1 and COMT have positive linear correlation in normal endometrium（r=0.384，P＜0.05）.ConclusionCYP1B1 may play an important role in the occurrence of endometrial cancer depending on ER.COMT plays a protective role in the occurrence and development of endometrial cancer.The two enzymes maintain the normal estrogenmetabolism in the body，and prevent excessive carcinogens production.

endometrial neoplasms；cytochrome P-450 enzyme system；receptors，estrogen

R737.33

A

1007-3205（2012）11-1241-04

2012-04-04；

2012-07-07

河北省科技廳科技支撐計劃項目（11276103D-30）

王瑾（1984-），女，河北涿州人，河北醫科大學第四醫院醫學碩士研究生，從事婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：lily_lucky1@yahoo.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.001