泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織TLR4/NF-κB信號通路的影響

陳文剛，陳建權，劉建平，榮英蕊，郎曉猛

（1.河北省玉田縣醫院內二科，河北玉田 064100；2.河北省中醫院消化內科，河北石家莊 050011；3.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊 050011）

泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織TLR4/NF-κB信號通路的影響

陳文剛1，陳建權1，劉建平2*，榮英蕊3，郎曉猛3

（1.河北省玉田縣醫院內二科，河北玉田 064100；2.河北省中醫院消化內科，河北石家莊 050011；3.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊 050011）

目的觀察泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路的影響。方法2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇混合溶液灌腸復制潰瘍性結腸炎大鼠模型。設正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄濁解毒方小劑量組、泄濁解毒方大劑量組；觀察大鼠結腸組織TLR4及NF-κB表達。結果與模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄濁解毒方小劑量組相比，泄濁解毒方大劑量組TLR4mRNA及NF-κB的表達均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論泄濁解毒方可明顯減少潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織TLR4及NF-κB表達，這可能是其對潰瘍性結腸炎治療作用的機制之一。

結腸炎，潰瘍性；泄濁解毒方；大鼠

潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種原因不明的慢性非特異性炎癥性腸病。多認為UC發病與免疫反應的異常有關，Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路在免疫調節中發揮著極其重要的作用［1］。泄濁解毒方為筆者課題組臨床實踐中篩選出的治療潰瘍性結腸炎的有效方劑，為進一步探討泄濁解毒方免疫調節作用機制，我們復制了2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇大鼠潰瘍性結腸炎模型，并在此模型上觀察泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織TLR4/NF-κB信號通路的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康成年雄性SD大鼠45只，體質量200～220g，由河北醫科大學實驗動物中心提供；動物等級，一級；合格證712101。

1.2 藥品與試劑：傳統泄濁解毒方（魚腥草20g、敗醬草18g、紅藤15g、葛根12g、車前子12g、黃連6g、黃芩6g、薏苡仁12g、木香3g等）為中藥復方，每毫升原液含生藥2.0g（成人1.45g·d-1·kg-1），由河北省中醫院制劑室提供。泄濁解毒方小劑量和大劑量（5.0g/kg、20.0g/kg）分別相當于臨床成人日用量的3.5和14倍。柳氮磺胺吡啶（salazosulfamide，SASP，上海三維制藥有限公司生產，批號200609C15）；2，4，6-三硝基苯磺酸、焦碳酸二乙酯（購自Sigma公司）；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（購自TaKaRa公司）；Trizol（購自nvitrogen公司）；一抗TLR4、SP免疫組織化學染色試劑盒、DAB染色試劑盒，均為北京博奧森生物工程開發有限公司產品。均按試劑盒說明書進行檢測。

1.3 模型制備：參考文獻［1-2］應用2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇方法制備大鼠潰瘍性結腸炎模型。實驗前禁食24h，自由飲水，在乙醚麻醉下，用直徑2mm的硅膠軟管輕插至結腸8cm處，推入含30mg 2，4，6-三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液，每只大鼠約0.5mL，捏緊肛門倒置10min即可。3d后，隨機抽取5只模型組大鼠處死，取其結腸標本，病理檢查確認有充血、水腫及典型潰瘍形成等一系列病理變化即為造模成功。

1.4 分組及給藥：按隨機數字表法將40只大鼠隨機分為5組。模型組8只，正常組8只，生理鹽水2mL灌胃；泄濁解毒方小劑量組8只，5.0g/kg中藥灌胃；泄濁解毒方大劑量組8只，20.0g/kg中藥灌胃；柳氮磺胺吡啶組8只，0.50g/kg灌胃。共14d。

1.5 操作方法：造模后第14天，2%烏巴比妥鈉腹腔麻醉（3mL/kg），解剖大鼠，沿矢狀線正中切開，留取距肛門以上8cm處結腸標本，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷生理鹽水沖洗腸內容物，迅速取部分結腸組織置于-70℃的液氮罐中，留做TLR4 mRNA，另取部分結腸組織，做免疫組織化學。

1.6 免疫組織化學染色（SP法）檢測NF-κB表達：NF-κB p65陽性細胞主要為黏膜細胞、單核細胞及巨噬細胞，陽性細胞胞質和胞核內均有棕色顆粒，以胞核為主。采用圖象分析技術，計數鏡下單位面積（1mm×1mm）內的平均陽性細胞數量；根據參考文獻［3］的評分標準法評估染色強度和陽性細胞數量分級，在40倍高倍鏡下選取典型視野計數100個細胞，其中陽性細胞數作為NF-κB p65計數值，并以百分率表示。

1.7 結腸組織TLR4 mRNA的表達：取組織100mg左右，放入勻漿器內，加入適量的Trizol用勻漿器勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀，然后轉移至新的離心管中，室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心5min，小心吸取上清液于另一離心管，加入1/5體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心15min。轉移上層水相到另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后室溫靜置10min，然后4℃12 000r/min離心10min，RNA形成白色的小團沉淀在離心管的底部和側面，棄上清，加入75%乙醇1m L，4℃12 000r/min離心5min，盡量棄上清，漂洗2～3次RNA沉淀。最后，在無菌工作臺中干燥RNA沉淀5～10min，加入焦碳酸二乙酯處理的50μL雙蒸餾水，55℃～60℃溫育10min使RNA充分溶解，取少許溶解的RNA，用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260和280nm處讀取A值，A260/ A280=1.8～2.0間方可使用，總RNA濃度= A260×稀釋倍數×0.04（g/L），用前調整為1g/L。

1.7.1 逆轉錄反應：取總RNA 2μg，加入逆轉錄反應體系（含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Pri-mer，AMV，Rnase Inhibitor等）管中，并用DEPC處理水補足到50μL反應液體積，振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀42℃30min（cDNA合成），99℃5min（逆轉錄酶失活），5℃5min。-20℃保存備用。1.7.2 PCR反應

1.7.2.1 PCR擴增引物：引物由北京塞百盛基因技術有限公司合成。Rat TLR4，退火溫度為55℃，上游引物，5′-GTGGGTCAAGGACCAGAAAA-3′；下游引物，5′-GAAACTGCCATGTCTGAGCA-3′；擴增片段為526bp，Rat GAPDH，退火溫度為52℃，上游引物，5′-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3′；下游引物，5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′；擴增片段為408bp。

1.7.2.2 PCR反應體系：反應體系含Taq DNA聚合酶，dNTPs，上樣染料，穩定劑，優化劑，反應緩沖液，逆轉錄反應產物，上下游引物等。振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴增。

1.7.2.3 PCR反應條件：PCR擴增條件，94℃變性3min；94℃40s，各自的退火溫度50s，72℃90s，30個循環；72℃延伸10min。

1.7.3 半定量分析：取每個標本的擴增產物6μL于1%含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker（DL2000）作為標準分子量標記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數碼相機照相，輸入微機應用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.8 統計學方法：應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠NF-κB p65的影響：與正常組相比，模型組NF-κB p65表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，泄濁解毒方小劑量組、泄濁解毒方大劑量組、柳氮磺吡啶組NF-κB p65表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與柳氮磺吡啶組相比，泄濁解毒方大劑量組NF-κB p65表達差異有統計學意義（P＜0.01），泄濁解毒方小劑量組表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與泄濁解毒方小劑量組相比，泄濁解毒方大劑量組核因子-κB p65表達差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 大鼠結腸組織NF-κB的表達

2.2 泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠TLR4mRNA表達的影響：與正常組相比，模型組TLR4mRNA表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，柳氮磺胺吡啶組、泄濁解毒方各組TLR4mRNA表達均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與柳氮磺胺吡啶組相比，泄濁解毒方大劑量組TLR4mRN的表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），泄濁解毒方小劑量組表達差異無統計學意義（P＞0.05）。泄濁解毒方大劑量組TLR4蛋白水平的表達低于泄濁解毒方小劑量組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠結腸組織TLR4m RNA表達

3 討 論

NF-κB在免疫及炎癥反應方面起著重要作用，有功能活性的NF-κB二聚體大都含p65亞單位，這樣的二聚體具有顯著的促炎活性［4］。TLR4是免疫系統中的跨膜受體，其介導的信號轉導通路參與了UC的發生發展。TLR4通過Toll/IL-1R同源結構域（Toll/ILIR domain，TIR）與其下游信號轉導分子，如髓樣分化蛋白88（mye-loid differentiation factor88，MyD88）、白細胞介素-1相關蛋白激酶、腫瘤壞死因子受體活化因子6（tumornecrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF6）和β-轉化生長因子激活的蛋白激酶（transforming growth factor-βactivatedkinase，TAK1）等相互作用，可促進下游NF-кB抑制蛋白激酶（inhibitorkinase of NF-кB，IKK）的2個亞型IKK-α和IKK-β的活化，最終使NF-κB轉移到細胞核內并活化；二是通過進化保守信號媒介（evolutionarily con-TRIF），TRIF通過N末端結合結構域與TRAF6結合，隨后激活IKK復合體，使NF-κB抑制蛋白活化，最終導致NF-κB釋放入核，最終引起腸黏膜的炎癥反應［5］。張弛等［6］以LPS刺激人臍靜脈內皮細胞，TLR4表達上調同時NF-κB p65活性增加。程方平等［7］研究發現甘露消毒丹對溫病濕熱證大鼠肝巨噬細胞TLR4mRNA及NF-κB p65表達具有較好的干預調控作用，能中止炎癥介質的轉錄，限制急性炎癥反應。

泄濁解毒方由魚腥草、車前子、紅藤、敗醬草、半夏、黃連、黃芩、葛根、生薏苡仁、木香組成，可明顯升高結腸黏膜CD+8含量，降低結腸黏膜CD+4的水平，使CD+

4/CD+8的比值保持一定比例，具有良好的免疫調節作用。本研究結果表明，與空白組相比，模型組NF-κB p65及TLR4mRNA均表達明顯升高，柳氮磺胺吡啶組及泄濁解毒方各組NF-κB p65及TLR4mRNA表達均降低，泄濁解毒方各組及柳氮磺胺吡啶組均可降低TLR4mRNA水平的表達及NF-κBp65蛋白水平的表達，尤其是泄濁解毒方大劑量組對TLR4mRNA及NF-κB p65的下調作用更為明顯。因此，泄濁解毒方治療潰瘍性結腸炎可能是通過降低TLR4mRNA轉錄水平，使TLR4蛋白合成、表達減少，阻斷TLR4/NF-κB信號通路的轉導，減少促炎因子釋放，抑制免疫系統的過度激活，糾正潰瘍性結腸炎異常的免疫炎癥反應而實現的。

［1］ 段征，汪維偉，姜蓉.兩種潰瘍性結腸炎大鼠模型的比較［J］.重慶醫科大學學報，2008，33（1）：66-68，72.

［2］ HAGARHH，EL-MEDANY A，EL-ETER E，etal.Ameliorative effect of pyrrolidinedithiocarbamate on acetic acid-induced colitis in rats［J］.Eur JPharmacol，2007，554（1）：69-77.

［3］ 王皓，歐陽欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結腸炎動物模型的建立［J］.胃腸病學，2001，6（3）：7-10.

［4］ 榮英蕊，劉建平，陳建權.泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織大鼠NF-κBp65及ICAM-1表達的影響［J］.上海中醫藥雜志，2010，44（3）：63-68.

［5］ 周紅光，陳海彬，吳勉華.從Toll樣受體/核因子-κB信號通路探討中藥免疫調節作用機制［J］.中國中西醫結合雜志，2010，30（8）：884-888.

［6］ 張弛，范建軍.參附注射液對臍靜脈內皮細胞Toll樣受體4/ NF-κB途徑的影響［J］.山西醫藥雜志，2006，35（9）：777-779.

［7］ 程方平，周潔，陳娟，等.甘露消毒丹對溫病濕熱證大鼠TLR4 mRNA、NF-κBp65表達的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2007，26（4）：478-482.

（本文編輯：趙麗潔）

R574.62

B

1007-3205（2011）07-0803-03

2011-09-21；

2011-11-04

國家中醫藥管理局濁毒實驗室資助項目（ZD200812-12）

陳文剛（1977-），男，河北玉田人，河北省玉田縣醫院主治醫師，醫學學士，從事消化內科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Liujianping0311@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.021