微波制備IFN-γ處理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，盧冬梅，孫立新

（承德醫學院附屬醫院小兒外科，河北承德 067000）

微波制備IFN-γ處理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏*，朱艷菊，丁曉旭，盧冬梅，孫立新

（承德醫學院附屬醫院小兒外科，河北承德 067000）

目的探討用微波方法制備干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）處理的小鼠H22肝癌細胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cellsmaking H22 tumor vaccine，MITTV-H22）激發機體的抗腫瘤免疫反應。方法小鼠皮下接種H22腫瘤細胞，同時于腫瘤接種部位皮下接種MITTV-H22進行免疫治療。觀察2組小鼠的生存期，治療結束后取瘤稱質量、測瘤體積、計算體積抑瘤率和質量抑瘤率、觀察瘤組織病理切片。結果①實驗組小鼠的平均生存期為46.5d，對照組小鼠的平均生存期為34.0d（P＜0.05）。②實驗組小鼠的瘤塊體積增長速度明顯慢于對照組（F=179.318，P＜0.0）。③實驗組小鼠的平均瘤體積、平均瘤質量小于對照組。④實驗組的體積抑瘤率為（57.80±18.40）%，質量抑瘤率為（62.65±23.53）%。⑤實驗組腫瘤組織壞死明顯增多，大片壞死組織中可見散在成團或島嶼狀的殘留瘤細胞，淋巴細胞多見，瘤體周邊纖維母細胞明顯增生。對照組腫瘤組織中瘤細胞增生活躍，局部可見小片狀壞死灶，腫瘤細胞間淋巴細胞極少見，瘤體周邊有很少或未見纖維母細胞增生。結論MITTV-H22對H22細胞型肝癌具有較強的治療作用。

肝腫瘤；癌癥疫苗；干擾素γ，重組；小鼠

目前腫瘤治療最具吸引力的生物學方法之一是腫瘤疫苗，由于腫瘤的抗原性較弱，難以激起機體足夠的抗腫瘤免疫反應，且腫瘤細胞表達多種腫瘤抗原，針對某個或某些表位產生的免疫應答不能有效地抑制腫瘤細胞的生長，全細胞瘤苗可表達多種腫瘤抗原。根據干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）增強腫瘤細胞的抗原遞呈能力，微波修復抗原提高病理切片的抗原性的原理，我們用IFN-γ處理H22腫瘤細胞，再用微波制備全細胞瘤苗，既消除了其致瘤性，又增強了其抗原性，且操作簡單。前期我們已經做過用小鼠H22肝癌細胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cells making H22 tumor vaccine，MITTV-H22）對H22細胞型肝癌的預防作用，結果實驗組小鼠于H22腫瘤細胞攻擊后的7d左右接種部位沒有發現肉眼可見的包塊，經解剖腫瘤接種部位未發現瘤組織。對照組于H22腫瘤細胞接種后第5或6天接種部位出現直徑＜0.5cm的包塊，成瘤率為100%，接種后7d平均瘤體積為（4.8±1.0）mm3。觀察120d，對照組小鼠平均生存期為（31.87±5.87）d，實驗組為（115.40±11.22）d，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。因此我們想進一步觀察MITTV-H22對H22細胞型肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞來源：健康的BALB/C小鼠60只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量14～16g，8周齡，正常飼養。H22瘤株由白求恩醫科大學提供，液氮凍存。使用時由液氮中取出，37℃水浴融解后，RPMI-1640培養液洗3遍，接種于含10%胎牛血清的1640培養基，培養至對數生長期，收集細胞接種于BALB/C小鼠腹腔傳代。

1.2 MITTV-H22的制備：收集BALB/C小鼠腹水H22腫瘤細胞，1640培養液洗2遍，用H22腫瘤細胞培養液培養，加入IFN-γ（200U/mL），37℃、5%CO2共培養48h［1］。收集H22腫瘤細胞，生理鹽水洗2遍，制成2.5×106/mL的H22細胞懸液，微波照射20s（750W、2 450MHz），經臺盼藍染色后光鏡下觀察證實H22腫瘤細胞已被全部滅活，制成MITTV-H22，4℃儲存備用。

1.3 實驗分組與動物模型的制備：60只小鼠檢疫10d后隨機分成2組，實驗組（A、C、E）與對照組（B、D、F），每組各30只，每個亞組各10只。每組小鼠右腋皮下接種H22腫瘤細胞（1×106個），同時實驗組于腫瘤接種部位皮下接種MITTV-H22（2.5× 106/mL）0.2mL進行免疫治療，每隔2天免疫1次，共6次，對照組用生理鹽水代替MITTV-H22進行治療對照。A、B 2組用于觀察小鼠的生存期。C、D 2組于腫瘤接種后的第6天開始用游標卡尺測量瘤體積，每隔2天1次，共6次，畫腫瘤生長曲線。E、F 2組治療6次后，取瘤塊稱質量、測體積、觀察病理切片。

1.4 實驗指標的檢測

1.4.1 瘤體積觀察：2組于腫瘤接種后的第6天開始用游標卡尺測量瘤體積，每隔2天1次，共6次。MITTV-H22治療6次后，取2組的瘤塊，測量瘤體積、電子天平稱質量。瘤塊體積的計算公式為，V= 0.4×a×b2（a為瘤塊長軸，b為瘤塊短軸）。質量抑瘤率=（對照組平均瘤塊質量-實驗組平均瘤塊質量）/對照組平均瘤塊質量。體積抑瘤率=（對照組平均瘤塊體積-實驗組平均瘤塊體積）/對照組平均瘤塊體積。

1.4.2 瘤體病理切片觀察：MITTV-H22治療6次后，取實驗組與對照組的瘤塊，用流水洗去組織表面的黏液及血液，然后投入有足量10%甲醛的容器中，固定時間不少于24h，進行HE染色。

1.5 統計學方法：應用SPSS15.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，分別采用重復測量設計的方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

實驗組小鼠的平均生存期為46.5d，對照組小鼠的平均生存期為34.0d（t=6.96，P＜0.05）。實驗組不同時點小鼠的瘤塊體積明顯小于對照組，差異有統計學意義（F=179.32，P＜0.05）。見表1。

表1 實驗組與對照組腫瘤體積的變化

實驗組小鼠的平均瘤體積為（0.67±0.21）cm3，小于對照組的（1.84±0.74）cm3，差異有統計學意義（t=4.78，P＜0.05）。實驗組小鼠的平均瘤質量為（0.67±0.35）g，低于對照組的（1.91±0.34）g，差異有統計學意義（t=7.96，P＜0.05）。實驗組的體積抑瘤率為（57.80±18.40）%，質量抑瘤率為（62.65±23.53）%。

HE染色瘤體病理學觀察，實驗組腫瘤組織壞死明顯增多，大片壞死組織中可見散在成團或島嶼狀的殘留瘤細胞，淋巴細胞多見，瘤體周邊纖維母細胞明顯增生。對照組腫瘤組織中瘤細胞增生活躍，局部可見小片狀壞死灶，腫瘤細胞間淋巴細胞極少見，瘤體周邊有很少或未見纖維母細胞增生（圖1～ 6）。

3 討 論

目前，腫瘤疫苗是腫瘤治療最具吸引力的生物學方法，但腫瘤疫苗最大的潛在問題是腫瘤抗原的免疫原性弱，機體免疫系統不能識別腫瘤細胞，從而無法徹底殺滅腫瘤。因此，提高腫瘤疫苗抗原的表達是提高宿主對腫瘤細胞免疫反應的關鍵。

絕大多數強免疫原性腫瘤引起細胞介導的免疫反應，T細胞分泌腫瘤特異性IFN-γ，腫瘤溶解壞死；而弱免疫原性或所謂的非免疫原性腫瘤則無抗瘤效應，腫瘤繼續生長。主動特異性免疫（自體疫苗）治療的策略就是使弱免疫原性腫瘤通過佐劑等手段予以修飾，增強其免疫原性，由免疫無效轉化為抗瘤反應［2］。

研究［3］發現，大多數腫瘤表面抗原減弱、細胞表面主要組織相容性抗原（major histocompatibilty complex classⅠ，MHC-Ⅰ）類分子的表達下調或丟失，導致免疫細胞的應答無能是腫瘤細胞普遍存在的生物學現象，也是導致腫瘤細胞逃逸機體免疫監視，逃逸特異性CTL抗腫瘤免疫應答的重要機制。IFN-γ是調節MHC-Ⅰ類抗原高表達的一個重要生物因子［4-6］，能直接抑制腫瘤細胞增殖，增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子的表達、抗腫瘤血管生成等［7］。

腫瘤細胞逃避機體的免疫攻擊的另一原因是腫瘤細胞表面“抗原覆蓋”或被封閉，因而腫瘤抗原不能被宿主的淋巴細胞所識別，不能有效地被殺傷。微波作為抗原修復的方法已廣泛應用于免疫組織化學染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復方法［8-9］。它可以使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫組織化學染色的敏感性。用微波處理惡性腫瘤細胞，制成瘤苗免疫小鼠，將有助于增強小鼠的抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。

本研究中實驗組小鼠的生存期高于對照組，實驗組小鼠的瘤質量和瘤體積均小于對照組。瘤體組織學觀察，實驗組小鼠皮下腫瘤組織大面積壞死，腫瘤周邊有較豐富的纖維母細胞及較多的淋巴細胞浸潤；而對照組小鼠的瘤組織有灶狀壞死，腫瘤周邊沒有或有很少纖維母細胞，淋巴細胞浸潤也少見。推測腫瘤大面積壞死和體積、質量小可能與腫瘤組織中大量淋巴細胞的浸潤和纖維母細胞增生有關。進一步推測MITTV-H22免疫可能促進淋巴細胞浸潤和纖維母細胞的增生。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

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R735.7

B

1007-3205（2012）07-0808-03

2011-11-30；

2012-02-01

楊曉峰（1975-），男，滿族，河北灤平人，承德醫學院附屬醫院主治醫師，醫學學士，從事小兒外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：caccine.tumor@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.023