植物Na＋/H＋逆向轉運蛋白研究進展

杜利霞，董寬虎，朱慧森

（山西農業大學 動物科技學院，山西 太谷 030801）

Na＋/H＋逆向轉運蛋白是細菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統上普遍存在的一種轉運蛋白，參與細胞質內的pH、Na＋濃度調節及細胞體積變化等生命活動［1，2］。在 GenBank中已經注冊的Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因序列已經達到400多個，氨基酸序列達236個［3］。近年來，Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因以及該基因表達活性的調節機制，蛋白的結構功能等的研究受到學術界的廣泛關注，特別是隨著研究的不斷深入，發現該蛋白在植物耐鹽性方面起重要作用。僅從Na＋/H＋逆向轉運蛋白的結構特點、生理功能及其與植物耐鹽性關系方面的研究進展進行論述。

1 Na＋/H＋逆向轉運蛋白的分類

1.1 質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白

植物Na＋/H＋逆向轉運蛋白活性首次在大麥中發現［4］，并定位于質膜，質膜 Na＋/H＋逆向轉運蛋白主要與植物對Na＋的外排有關，是植物抗拒鹽離子毒害的首個屏障。

在酵母中首次克隆了質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因（SOS1）［5］。植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因是Shi等［6］2000年首次從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆到，植物中的SOS1定位于葉和根的質膜上，分子量為127kDa。在SOS1和其他質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白氨基酸序列中，均存在一個非常保守的Na＋結合區，沒有發現氨氯吡咪（Na＋通道阻斷物）結合位點［7，8］。其 N末端為一個疏水結構，可能由10～12個跨膜結構域組成，跨膜區和微生物、動物的Na＋/H＋逆向轉運蛋白序列類似，SOS1序列另一個特征是它有個長的親水尾部，將近700個氨基酸，尾部面向細胞質，就有更多機會跟那些調控逆向轉運蛋白活性的諸多蛋白相互作用，以此達到調節Na＋/H＋運輸，適應鹽環境的目的［7，8］。Shi等［6］利用圖位克隆策略克隆到的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白SOS1基因的研究發現，該基因位于擬南芥的第2染色體上，具有22個內含子和23個外顯子，編碼1 146個氨基酸。

已經克隆的植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因（表1）。在克隆質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因過程中，研究者發現絕大多數高等植物的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白均有單基因編碼［10，11］。目前僅在海草（Cymodocea nodosa）［12］和昆諾阿藜（Chenopodium quinoa）［7］中分別克隆到2個編碼質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白的基因。可見，大多數植物的質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白可能是一個單基因家族。

1.2 液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白

液泡膜Na＋/H＋逆向轉運活性首次被發現是在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上［13］，之后，許多具有液泡膜Na＋/H＋交換活性的植物陸續被發現。Nass等［14］在篩選酵母cnb1突變體的抑制子時，發現了1個與耐鹽性有關的新基因NHX1，它編碼Na＋/H＋逆向轉運蛋白，定位于液泡膜上負責將Na＋區隔化入液泡。將Na＋的區隔化入液泡，是酵母及植物降低細胞質內Na＋水平的另一途徑，一方面減少了Na＋在細胞質內對細胞器的毒害作用，另一方面也降低了植物細胞的滲透勢，有利于植物在高鹽低滲的環境下吸收水分，維持植物的生長。

表1 克隆的植物質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因Table 1 The plasma membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

Sardet等［15］完成了第1個液泡膜 Na＋/H＋逆向轉運蛋白（NHE）的分子克隆，其氨基酸序列的親水性圖譜顯示Na＋/H＋逆向轉運蛋白的N末端結構域是由大約500個氨基酸形成的12個跨膜片段組成，這一區域對Na＋/H＋逆向轉運蛋白的底物、Na＋的競爭性抑制劑氨氯吡咪及其衍生物敏感，是負責轉運的區域；與之相連的C末端結構域由大約300個氨基酸組成，位于細胞質一側，此結構域內含有多個蛋白激酶作用位點，能夠與鈣調素結合，參與多種信號反應，是調節活性的區域。酵母液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白（NHX1）與NHE家族類似，也是內在蛋白，N末端結構域含有12個跨膜的片段，由633個氨基酸組成［14］。擬南芥的Na＋/H＋逆向轉運蛋白（AtNHX）與酵母的NHX1以及人的NHE6結構相似，由538個氨基酸組成［16］。擬南芥液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白可以分為9個跨膜結構域和一個親水C端結構域；跨膜區為疏水，呈螺旋狀，含有Na＋結合的重要殘基。這些區域含有陽離子運輸的結構，其中的3個疏水區為非跨膜結構，而與液泡膜顯示出一定的關聯。其N端處于細胞質中，而幾乎整個的C端親水區處于液泡膜內［17］。

表2 已克隆的一些植物液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因Table 2 The tonoplast membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

2 Na＋/H＋逆向轉運蛋白的功能

2.1 Na＋的外排

Na＋從土壤向根中的單向運輸有一個重要特點，就是高速。盡管Na＋的內流速率很高，但根部并沒有快速積累Na＋。而且在鹽漬環境中，隨時間的延長，根部的Na＋含量變化不大，但地上部分的Na＋含量卻趨向于升高，但速度很慢，這暗示穿過質膜的Na＋外流量很大［18］。Na＋外排是避免Na＋在細胞質中積累的一種直接途徑。植物將Na＋排出細胞外時需逆著電化學勢梯度，是一個主動運輸過程。在高等植物中，Na＋的外排是通過質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白實現，且質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白的基因是高等植物中唯一具備將Na＋排到細胞外功能的離子平衡調節基因［19］。質膜 H＋－ATPase（P－ATPase）用水解ATP產生的能量將H＋從細胞質中泵出細胞，產生跨質膜的 H＋電化學勢梯度，提供能量，從而驅動質膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白，使H＋順其電化學勢進入細胞，Na＋則逆電化學勢排出細胞［20］。這一點已經得到Vitart等的證實［21］。

2.2 Na＋區隔化

無論是鹽生植物還是非鹽生植物的細胞質中酶對Na＋都非常敏感。為了保持胞質內Na＋的非毒性水平，植物細胞除了將胞質中的Na＋排出細胞以外，另一個途徑就是將細胞質中的Na＋區隔化入液泡。Na＋區隔化至液泡中后，一方面降低了胞質中的Na＋濃度，避免胞質中過高Na＋對生理生化代謝的干擾；另一方面還可降低植物細胞水勢，促進植物從外界吸水，從而有利于植物在鹽漬化土壤上的生存。Na＋進入液泡是通過液泡膜上的 Na＋/H＋逆向轉運體完成［22，23］。液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白行使功能需要依賴于液泡膜上的H＋－PPase和H＋－ATPase所產生的跨膜質子電化學勢梯度為驅動力，將胞質Na＋區隔化入液泡中。這意味著通過增大液泡膜質子泵基因表達來增大H＋跨膜梯度，可以為液泡膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白介導Na＋/H＋交換提供更強大的驅動力，這樣就有可能將細胞質中過多的Na＋區隔化到液泡內腔中，增強細胞的耐鹽性。該觀點已由Li等［24］證實，研究過量表達鹽地堿蓬 Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因SsNHX1和擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVP1的擬南芥植株比野生型擬南芥植株有更強的抗鹽能力。從而證明，鹽脅迫下液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白、H＋－PPase和 H＋－ATPase三者需要協調工作，才能最有效的將細胞質中過多的Na＋區隔化入液泡，這樣，Na＋含量可降低到無毒害水平，從而增加植株的耐鹽性。

2.3 調節pH值

SOS1外排Na＋的同時，將細胞外的H＋轉運至胞質中，使細胞質酸化，從而有利于細胞質中代謝活動的正常進行［25，26］。SOS1的 Na＋/H＋轉運活性受到抑制時（如SOS1突變），擬南芥根部H＋內流受到抑制，細胞質發生堿化，pH值顯著升高［27］。由此可見，質膜Na＋/H＋逆向轉運蛋白具有調控細胞pH值的功能［28］。Na＋/H＋逆向轉運蛋白影響細胞質或細胞器pH的變化，同時也影響細胞生長對環境pH的要求。如野生型擬南芥的細胞質pH約為7.0，但chx2321突變株則為7.4，突變株在pH 4.0的環境下較pH 7.0的環境中生長良好［29］。啤酒酵母在堿性條件下，利用質膜Na＋－ATP酶將Na＋泵出胞外，但在酸性環境下則是利用Na＋/H＋逆向轉運體將Na＋排出細胞。可見，Na＋/H＋逆向轉運蛋白參與了細胞質內pH的調節。

3 Na＋/H＋逆向轉運蛋白與耐鹽性的關系

目前酵母和高等植物的Na＋/H＋逆向轉運蛋白倍受重視，Na＋通過Na＋/H＋的逆向轉運在液泡中積累或排除細胞質外是植物耐鹽性的重要機制［30，31］，是鹽生植物和耐鹽甜土植物的主要特征［32，33］。甜土植物體內不存在Na＋/H＋逆向轉運蛋白基因，有無鹽處理都不顯示Na＋/H＋逆向轉運活性；耐鹽的甜土植物通過NaCl脅迫誘導出Na＋/H＋逆向轉運活性：如75mmol/L NaCl和150mmol/L NaCl處理向日葵，其根部液泡膜微囊上的Na＋/H＋逆向轉運蛋白對Na＋的 Km 分 別 為 64mmol/L 和 8mmol/L，而Vmax不變，說明鹽處理沒有改變Na＋/H＋逆向轉運蛋白的數量，只是Na＋激活了已經存在的Na＋/H＋逆向轉運蛋白［34］；鹽生植物Na＋/H＋逆向轉運活性是結構性的，無鹽條件下Na＋/H＋逆向轉運活性較低，鹽處理后由于Na＋/H＋逆向轉運蛋白的合成增加，其活性也增加，所以說Na＋/H＋逆向轉運蛋白的有無及其活性高低與植物的耐鹽性密切相關。

土壤鹽漬化是農業生產面臨的最嚴重的非生物逆境之一，工程措施解決鹽漬化的可能性甚小，因而培育耐鹽的作物品種是未來農業發展的有效途徑。對于植物耐鹽工程而言，獲得關鍵的耐鹽基因尤為重要，Na＋/H＋逆向轉運蛋白在植物抵御鹽脅迫中發揮著重要作用，這類蛋白可以維持Na＋在植物體內的穩態，從而減輕過多的Na＋對細胞造成的毒害。隨著人們對植物耐鹽性機理的進一步了解和分子技術的提高，對該基因分離、克隆，并轉移到非抗鹽的農作物中，對與傳統的育種方法結合，會得到大量的抗鹽性植物新品種改良鹽堿地，經濟效益可觀，應用前景廣闊。

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