加味四逆散對睡眠剝奪大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體表達的調節作用

范新六 李 峰 宋月晗 洪志強 馬佳美 劉 燕

(1世界中醫藥學會聯合會北京御方堂中醫門診部，北京市朝陽區小營路19號，100101;2北京中醫藥大學;3世界中醫藥學會聯合會)

NMDA受體依賴性長時程增強(Long-term Potentiation，LTP)是突觸可塑性的重要形式，而NMDA受體NR2亞基是其信號轉導通路的關鍵環節;前額葉皮質和海馬CA3區是參與學習與記憶的兩個重要腦區。因此，本實驗探討睡眠剝奪大鼠前額葉皮質和海馬CA3區與突觸可塑性關系密切的NMDA受體NR2亞基(含磷酸化位點)蛋白質表達的變化及加味四逆散對其調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 二級Spargue-Dawley雄性成年大鼠50只，體重(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。將大鼠適應性喂養3d后隨機分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、四逆散組(C組)、生慧湯組(D組)、加味四逆散組(E組)，共5組，每組6只。

1.2 藥物 實驗所用的中藥復方分別選用《傷寒論》的四逆散(甘草、枳實、柴胡、芍藥)、《辨證錄》的生慧湯(熟地黃、山茱萸、遠志、生酸棗仁、柏子仁、茯神、人參、石菖蒲、白芥子)、加味四逆散由四逆散和生慧湯合方組成。上述復方由北京東直門醫院制劑室以嚴格工藝制成免煎顆粒。

1.3 試劑與儀器 NMDAR2B、β-actin(Santa Cruz，USA)，NMDAR 2B(Tyr1472)(Abcam，USA)。蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光液、5×上樣緩沖液(北京普利來基因技術有限公司)。PMSF(Merck，Germany)，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、SDS(Amresco，USA)。PVDF膜(Millipore，USA)。垂直電泳儀、電轉槽(Bio-Rad，USA)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用D.Suchecki改良多平臺法進行睡眠剝奪。在剝奪箱中放置10個平臺，在平臺周邊注滿水，把6只大鼠放置平臺上，當大鼠進入異相睡眠時，由于全身肌肉張力降低，節律性地垂頭觸水或落入水中覺醒，從而使動物始終不能進入異相睡眠。將大鼠進行異相睡眠剝奪168h。自造模第1天始，C、D、E組每日分別灌服四逆散、生慧湯、四慧合劑，按人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量，這3組的給藥量分別為 2.5g/kg、13.75g/kg、16.25g/kg，灌胃容積為1mL/kg。A、B組則灌服等體積的蒸餾水。

1.4.2 取材 在SD168h點，每組隨機取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)，斷頭，在超凈臺內冰上取腦，分別剝離出右側PFC和海馬CA3區，將樣本分別放入1.5mL滅菌的離心管中，埋入干冰，迅速轉移到-70℃的低溫冰箱中。

1.4.3 Western blot流程 使用微電動勻漿器勻漿后，采用RIPA裂解液(預冷)提取細胞總蛋白。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后，-20℃保存待測。蛋白標本以1∶4加入5上樣緩沖液，在5%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。每條泳道蛋白上樣量為30μg。電泳結束后，用電轉儀將蛋白質轉移至PVDF膜上。轉移后的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗兔抗NMDAR2B或NMDAR 2B(Tyr1472)(1∶300)，4℃過夜。用 TBS洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2000)，室溫孵育1h，TBS充分洗膜。采用超敏發光液進行曝光，X線顯影。將膠片的目的蛋白質條帶在圖像分析系統上測定其灰度值。

1.5 圖像處理 采用凝膠圖像處理軟件檢測出各條帶的像素灰度值，用各指標的像素密度值除以相應的β-Actin的像素灰度值，求出各指標的相對像素灰度值。1.6統計學方法實驗數據均以(ˉx±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，組間比較用單因素方差分析檢驗。運用SAS8.2軟件進行分析。

2 結果

2.1 各組大鼠PFC和海馬CA3區NMDAR2B表達的改變 與對照組比較，模型組大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體NR2B蛋白質的表達明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，加味四逆散組大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體NR2B蛋白質的表達均明顯增加(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠各腦區NMDAR2B達的改變(ˉx±s，n=6)

2.2 各組大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體NR2B(Tyr1472)表達的改變 與對照組比較，睡眠剝奪168h后，大鼠PFC腦區NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質的表達明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，加味四逆散組大鼠PFC腦區NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質的表達均明顯增加(P＜0.05)。各組大鼠海馬CA3區NMDA受體NR2B(Tyr1472)蛋白質的表達無明顯差異。見表2。

表2大鼠各腦區NMDAR 2B(Tyr1472)表達的改變(ˉx±s，n=6)

3 討論

研究表明，前額葉皮質和海馬CA3區是參與學習與記憶的重要腦區。人體和動物實驗的研究都提示前額葉腦區與工作記憶之間存在緊密的聯系［1］。功能神經成像研究表明事件記憶的編碼過程與左側前額葉的激活是有關的，而記憶的提取則與右側前額葉的激活有關，前額葉的背外側區是參與工作記憶的最重要的腦區。海馬CA3區在陳述性記憶中扮演主要的角色。譬如在記憶編碼上，CA3-NR1敲除顯示損傷了需要快速獲得聯合信息的任務學習［2］。學習與記憶神經生物學基礎為突觸可塑性的改變，而LTP是突觸可塑性重要的功能指標。NMDAR2B在NMDA受體依賴性LTP誘導和維持處于主導地位。NMDAR2B主導的NMDA受體的膜表達和激活受到絲氨酸和酪氨酸位點磷酸化的特異性調控。與Ser1480位點磷酸化能減少NMDA受體在膜的表達量不同，其Tyr1472位點的磷酸化能穩固NMDA受體在胞膜的穩定性［3］。

根據中醫五藏神理論，心藏神，肝藏魂，腎藏精。加味四逆散以補腎、養心、疏肝立法，能調節心肝腎功能異常，使肝腎二藏在心“任物”功能主宰下調控學習，記憶的編碼、鞏固、再現等過程。本研究證明，加味四逆散能上調睡眠剝奪導致動物PFC區NMDAR2B、NMDAR2B(Tyr1472)表達的降低;也能上調睡眠剝奪導致海馬CA3區NMDAR2B表達的降低。根據既往研究結果［3］，加味四逆散能改善睡眠剝奪動物學習記憶能力，與調節PFC和CA3區NMDAR2B的蛋白質和基因表達有關。

［1］Bussey TJ，Wise SP，Murray EA.The role of ventral and orbital PFC in conditionalvisuomotor learning and strategy use in rhesus monkeys(Nacacamulatta).BehavNeurosci，2001，115(6):971-982.

［2］Nakazawa K，Quirk MC.Requirement for hippocampal C.A3 NMDA receptors in associative memory recall.science，2002，297(5579):211 –218.

［3］范新六，李峰，宋月晗，等.四慧合劑對疲勞大鼠學習記憶及海馬NMDA受體亞基NR2A、NR2B和EphB2受體mRNA表達的影響.中國中西醫結合雜志，2011，31(4)512-516.