新型188RE（Ⅴ）-N-TDD類配合物的結構性質關系研究

魏洪源，王關全，王文進，羅順忠

（中國工程物理研究院 核物理與化學研究所，四川 綿陽 621900）

186Re、188Re因其具有優良的核素性質，一直是放射性治療藥物研究的熱點［1］，目前研究最多的是錸的五價化合物，大多數配合物含有以［188Re＝O］3＋為中心的金屬核。受同族［99Tcm≡N］2＋核配合物研究結果的啟發［2－4］，［188Re≡N］2＋化合物也得到了更多關注。［188Re≡N］2＋化合物具有相應［188Re＝O］3＋化合物更優的穩定性、不同的電性和脂溶性，因此可能獲得更具有應用價值的化合物。本研究小組已合成了S2N2類配體2，2，9，9-四甲基-4，7-二氮-1，10-二硫癸烷（TDD）衍生物，并制備了相應的188Re（Ⅴ）-O-配合物，用于碘化罌粟油的標記，希望獲得有前景的放射性肝動脈灌注栓塞治療劑，但標記物的產率和穩定性都不太理想［5］。此后，在改進［188Re N］int2＋中間體制備方法［6］的基礎上，制備了含［188Re≡N］2＋核的 TDD 類 配 合 物［7－8］。本工作在該優化制備方法基礎上，對配合物的體外穩定性、脂溶性和反相HPLC色譜行為等性質進行了測定。密度泛函理論（DFT）在研究99Tcm、188Re配合物的結構、成鍵和性質方面已取得較好的結果［9－10］。因此，為進一步深入了解所制備的188Re（Ⅴ）-N-TDD類配合物的性質，本工作擬采用DFT方法對配合物的結構和成鍵進行計算，并使用極化連續介質模型（Polarizable Continuu m Models，PCM）計算配合物在水中的絕對溶劑化自由能。通過結構和性質的關聯討論該類配合物的結構效應，希望通過構效關系的研究減少藥物設計中的盲目性，為改進現有配體分子的結構及設計新的配合物提供理論指導。

1 主要試劑與儀器

FJ-2021型γ免疫計數器：西安核儀器廠；HPLC系統：由 BECK MAN 421 Contr oller，BECK MAN 110B Sol vent Delivery Module，BECKMAN Model 170 Radioistope Detector組成；聚酰胺薄層板：浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠提供；188W－188Re發生器：中國科學院上海應用物理研究所提供。

丁二酰肼 （SDH）、Sn Cl2·2 H2O：美 國Al drich公司提供；其他試劑均為市售分析純。2，2，9，9-四 甲 基-4，7-二 氮-1，10-二 硫 癸 烷（TDD，L1）、2，2，9，9-四甲基-4，7-二氮-4-乙撐哌啶-1，10-二硫癸烷（NEPTDD，L2）、2，2，9，9-四甲基-4，7-二氮-4-乙撐-（4-甲基）哌啶-1，10-二硫癸烷（NEMPTDD，L3）和2，2，9，9-四甲基-4，7-二氮-4-乙撐-（3，5-二甲基）哌啶-1，10-二硫癸烷（NEMMPTDD，L4）：均為本課題組合成并經過分析確認，其結構簡式示于圖1。

圖1 TDD及其衍生物結構簡式

2 實驗方法

2.1 188 Re N配合物的制備和體外性質測定

2.1.1188Re N配合物的制備

依照本課題組改進的中間體制備方法［7－8］制備［188Re N］int2＋中間體。其放化純度大于98%，放射性濃度約為148 GBq／L。

取0.5 mL ［188Re N］1nt2＋中間體，分別加入1 mL（10 g·L－1）相應的配體，調p H至7，70℃水浴反應30 min。溶液由棕黃色變為無色，得到相應的188Re N配合物。

使用TLC和反相HPLC測定188Re N配合物的標記率和放化純度。TLC分析時，以聚酰胺薄膜為支持體，生理鹽水和乙腈為展開劑。反相 HPLC分析時，固定相為C-18反相柱（250 mm×4.6 mm，Dia monsil T M），流動相為0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液和乙腈混合液梯度淋洗，流速為1 mL·min－1。

2.1.2188Re N配合物的脂水分配系數

采用Shaking Flask法測定188Re N配合物的脂水分配系數（l g PO／W）：向10 mL離心管中加入1.4 mL PBS（每100 mL含116 mg Na OH和680 mg KH2PO4，p H＝7.4）溶液和0.1 mL制備好的188Re N配合物，再加入1.5 mL經PBS飽和的正辛醇，振搖15 min，3 000 r／min離心15 min。分別取0.1 mL有機相和水相，測定兩相放射性計數，計算其lg PO／W。

2.1.3188Re N配合物的體外穩定性

標記原液的穩定性：將制備好的188Re N配合物敝口放置，于不同時間點取樣，用反相HPLC分析其放化純度。

生理鹽水中的穩定性：將制備好的配合物用生理鹽水稀釋10倍和100倍，37℃溫育后用反相HPLC測不同時間點的放化純度。

小牛血清溶液中的穩定性：188Re N配合物加入到1.0 mL小牛血清中（預先用100 mmol／L、p H7.0的磷酸緩沖溶液稀釋，體積比為1∶100），37℃溫育后于不同時間點取樣，在所取樣品中加入乙腈后離心，取上清液分析其放化純度。

2.2 體外競爭實驗

取適量配合物分別加入預先配制的1.0和10.0 mmol／L的L-半胱氨酸的磷酸緩沖溶液（100 mmol／L，p H7.0）、組胺酸或0.02 mol／L谷胱甘肽或0.02 mol／L牛血清白蛋白，另以等量的生理鹽水作對照。37℃溫育，于不同時間點分析放化純度。

188Re N配合物的電性測定：點樣于新華濾紙中部，磷酸鹽緩沖液（p H7.4）作溶液介質，電壓150 V，電泳90 min。此后測量正、負極及原點的放射性計數，并計算其占總放射性計數的百分比。

2.3 配合物的密度泛函和溶劑化自由能計算

用DFT的B3LYP（Gaussian03程序）方法對配合物進行結構優化及能量計算［9］。C、H、O、N、S原子采用6-31G＊基組，金屬Re使用雙－ζ的LANL2DZ贗勢基組。配合物初始結構參考與文獻［11-12］相近似的配合物建模，電子布居分析使用Mulliken Population Analysis。使用自洽反應場理論（SCRF）計算配合物的絕對溶劑化自由能，方法為極化連續介質模型（PCM）。

3 結果與討論

3.1 188 Re N配合物的制備和性質測定

3.1.1188Re N配合物的制備

188Re N配合物的制備為兩步法，即先制備高純度中間體［188Re N］int2＋，再通過配體交換反應獲得相應188Re N配合物。［188Re N］int2＋的制備過程中N給予體、促進劑和還原劑等是決定產率的關鍵因素。在Tc≡N核配合物研究［2－3］中，曾使用一些制備相對困難的硫代酰肼作為N給予體。本工作選擇丁二酰肼（SDH）作為N給予體，產率可達95%以上，且中間體單一。優化的中間體制備條件為：1.0 mL （10 g·L－1）SDH、0.6 mL（100 g·L－1）草酸、0.2 mL188Re O4－（生理鹽水淋洗液，約37 GBq·L－1）、0.2 mL（1 g·L－1）NH4Re O4、0.2 mL （10 g·L－1）Sn Cl2·2 H2O，調p H 至2.0，室溫反應30 min，得到［Re N］int2＋中間體，反應液呈棕黃色。采用HPLC分析所得中間體，結果示于圖2。由圖2可知，中間體保留時間tR1＝16.8 min（圖2a），188Re O4－保留時間tR2＝19.5 min（圖2b）。

［Re N］int2＋中間體合成過程中，草酸作為促進劑，其作用非常明顯，如在SDH用量為10 mg，NH4Re O4用量為0.2 mg，188Re O4－淋洗液用量為0.2 mL（約37 MBq·mL－1），Sn Cl2·2 H2O用量為2 mg，p H 為2.0，室溫反應30 min的條件下，草酸使用量對產率的影響列于表1。由表1可以看出，當草酸用量從15 mg提高到60 mg時，產率也從88.5%上升到96.0%。

圖2 不同配合物體系的HPLC圖譜

表1 草酸用量對產率的影響

188Re O－還原制備放射性藥物時，188Re（Ⅶ）中心必須從四配位、四氧陰離子轉變為通常有五到六配位的最終化合物，即分子幾何結構從四面體變為一個擴張的四方錐或者八面體結構。一般來說，這個幾何結構的變化過程使標準還原電勢Eo急劇降低。曾有學者［13］基于配位化學中“配位構型擴張”的理論［14］提出該問題解決方法，即可以通過一些合適的試劑把四面體高錸酸陰離子變為一個四方錐或者八面體188Re（Ⅶ）中間體，但不改變Re氧化狀態來達到消除Eo急劇降低的效果。草酸根離子（C2O42－）就是一個可以生成具有擴張的配位幾何結構的188Re（Ⅶ）中間體的試劑，能顯著提高最終配合物的產率。

在中間體溶液加入相應配體，中性條件下反應30 min即可得到相應的配合物。使用TLC和HPLC分析其產率和放化純度。HPLC分析中，使用常規的流動相進液順序（先高極性后低極性）無法將3種配合物分開，因此通過多次實驗進行優化，優化后進液順序與常規的方式有所不同，即流速為1 mL· min－1，流動相為：A＝0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液，B＝乙腈；0～7 min，100%B；7～18 min，20%A，80%B；18～20 min，100%A；20～25 min，100%B。所得Re（Ⅴ）-配合物的HPLC結果示于圖2。由圖2c、圖 2d、圖 2e、圖 2f可知，188Re N-TDD（188Re N-L1）保留時間為tR3＝13.2 min；188Re NNEP-TDD（188Re N-L2）的 保 留 時 間 為tR4＝12.9 min；188Re N-NEMP-TDD（188Re N-L3）的保留時間為tR5＝12.7 min；188Re N-NEMMPTDD（188Re N-L4）的保留時間為tR6＝12.4 min。分析表明，標記體系中的主要放射性成分為188Re（Ⅴ）-N-L 配 合 物，其 產 率 和 放 化 純 度 大 于95%，幾乎沒有未還原的188Re O4－存在，只有極微量的膠體錸存在（tR＝3.4 min）。TLC分析各物質的Rf列于表2。由表2可知，選擇的分析條件能夠有效分開各個組份，適于本制備體系的分析測定。TLC分析得到了與HPLC分析相同的結果，表明制備方法簡便高效，能夠獲得高產率的錸氮核配合物。

表2 TLC分析中的R f

3.1.2188Re N配合物體外穩定性

室溫敞口放置24 h，配合物放化純度幾乎沒有降低。稀釋后和在小牛血清溶液中溫育24 h后，放化純度仍大于90%。在競爭配體L-半胱氨酸、組氨酸、谷胱甘肽和牛血清白蛋白存在情況下，12 h后的放化純度變化很小，仍均大于85%，提示配合物有較好的體外穩定性。

3.1.3188Re N配合物脂水分配系數

188Re N－L1、188Re N－L2、188Re N－L3、188Re NL4的脂水分配系數（l g PO／W）分別為1.12、1.43、1.48和1.64，為脂溶性較好的配合物，且其脂溶性 按188Re N－L1＜188Re N－L2＜188Re N－L3＜188Re N-L4順序增大。

電泳實驗結果顯示，有97%以上都停留在原點，負極的放射性為2.6%，正極的為0.4%，表明所有188Re N配合物都為電中性物質（零電荷）。此結果進一步證明188Re N配合物有良好的脂溶性。

3.2 配合物的DFT計算和構效關系

配合物的三維結構示意圖示于圖3。對于本工作涉及的N2S2類四齒配體，與Re直接配位的兩個N原子為sp3雜化，其中一個N原子上連接有取代基。根據sp3雜化N原子上取代基R或H原子相對于Re≡N（或Re＝O）的空間取向，可能存在syn（兩者都位于S2N2近似平面的同側）和anti（兩者位于S2N2平面的異側）兩種異構體［15］。本工作分別計算了兩種異構體的能量和結構。從計算結果來看，所有配合物為五配位，結構為變形的四方錐結構。由于空間位阻效應，所有的syn異構體的能量都比anti異構體的低，差值在10～100 kJ／mol范圍內，且取代基越大，這一差值越大，因此配合物的穩定構型均為syn異構體，這與絕大多數的Re-N2S2類配合物的X－衍射晶體結果［9］一致。

圖3 188 Re（Ⅴ）-N-TDD配合物結構簡式

本工作對syn構型的主要計算結果列于表3。由表3可知，兩個S原子和兩個N原子近于同一平面，隨著sp3雜化N原子上的取代基R（乙撐哌啶）的加入，該平面有一定的變形，有取代基的N原子略高于平面，二面角S-N-N＊-S＊也由最初188Re N-TDD 的3.6°增加到188Re NNEPTDD的8.9°。O2－和 N3－都是很強的π授體，可與金屬錸形成非常穩定的化學鍵。與前期制備的該類配體的Re＝O核配合物［2］相比，不同錸核配合物中Re≡N鍵比Re＝O［14］的鍵長短3 p m，Re≡N核上的Re原子的凈正電荷比Re＝O核上Re原子平均低30%，電子重疊集居數Re≡N比Re＝O高約20%。因此N3－是比O2－更強的π授體，Re≡N鍵比Re＝O鍵更穩定。配體經過乙撐哌啶修飾后，配合物分子的極性明顯增加，由于空間位阻增大，使其連接的N原子和Re之間的配位鍵的鍵長增長，整個配合物的空間結構的穩定性下降。這一空間位阻效應在Re＝O配合物的制備難易程度和穩定性趨勢方面體現明顯，如188Re-O-L3和188Re-O-L4制備條件更嚴格，且產率較低（最大約85%），稀釋穩定性和競爭穩定性也較差，RCP很快降低到70%。但通過配體交換反應與更強的N3－π授體形成的Re≡N配合物的制備過程中這一現象不明顯，反應條件和產率都很近似，產率＞95%，且穩定性很好。在乙撐哌啶上增加不同數目的甲基，空間位阻變化幾乎為零，不影響與Re≡N核的成鍵，對結構的影響幾乎觀察不到，并且分子極性沒有變化。

許多物理、化學以及生物過程本質上是由分子之間的相互作用決定，其中疏水作用在藥物的代謝、排泄和體內行為中起著重要作用。如本工作希望增大配合物的疏水性（即親脂性），從而增加錸配合物在碘化罌粟油中溶解性，改善肝動脈灌注栓塞治療效果。當前疏水作用研究不夠成熟，量度困難。由于疏水效應與溶劑分配現象有關，因此通常將分子在油／水體系中的分配系數作為疏水性的宏觀度量。一般選擇正辛醇－水體系，其原因是該體系更與生物體系接近。分配系數是一種平衡常數，與自由能成對數線性關系（LFER），因此通常以對數形式（l g PO／W）出現在定量構效關系研究中。本工作測定了所制備的Re（Ⅴ）-N-TDD類配合物的l g PO／W，從測量結果來看，親脂性隨著側鏈修飾基團的增加而增加，即188Re N－L1＜188Re N－L2＜188Re N－L3＜188Re NL4依次增大，與設計目標一致?；衔镌诜聪郒PLC系統上的保留時間和水溶性（或脂溶性）有較好的相關性［16］，一般來說，脂性溶性越強，其色譜保留時間越短，因此實驗中也常通過建立l g PO／W與色譜保留指數之間的定量關系，再根據較易測定的色譜保留指數來推算l g PO／W，比較其親水（親脂）性質，這同樣是線性自由能關系的另一種表達形式。不同配合物HPLC保留時間結果表明，保留時間188Re N-L1＞188Re N-L2＞188Re N-L3＞188Re N-L4，即 預 示 著 親 脂 性 按188Re N－L1＜188Re N－L2＜188Re N－L3＜188Re N－L4順序增大，與lg PO／W的測定結果一致。

在理論計算方面，自治反應場（SCRF）理論、Onsager模型和PCM模型都能計算溶劑效應對化合物性質的影響［17－19］。其中PCM 模型可以計算化合物的溶劑化自由能，從而定量其親水（親脂）性，因此本工作采用了PCM模型計算錸氮核配合物的水溶劑化自由能。在可極化連續勢模型（PCM）中，溶劑化自由能定義為完成以下過程所做的可逆功：從溶質分子與溶劑之間相互無作用到在連續分布的溶劑中形成一個空腔并把溶質分子放置于其中。溶劑化后體系總自由能ΔGS由下式計算：

表3 配合物B3LYP計算部分結果

（1）式中，ΔGel為靜電能；ΔGnon－elc為非靜電能；ΔGdis－rep為溶質－溶劑的色散－排斥能；ΔGcav為空穴能，即在原來應該是溶劑的地方形成一個空腔所需要做的功；ΔGmm包括各種分子運動的貢獻，如零點能，振動、平動、轉動等等，這一項可以采用經典統計力學方法通過振動分析進行計算。因為在計算時忽略溶劑化前后的分子構型變化，因此Gmm變化?？梢院雎浴８鶕斯接嬎愕?88Re（Ⅴ）-N-配合物水溶劑化自由能列于表4。由表4可以看出，配合物的水溶劑化自由能的大小依次為188Re N－L1＜188Re N－L2＜188Re NL3＜188Re N-L4。此結果說明，配合物的水溶性按此順序減小，而脂溶性按此順序增大，這與所測定的配合物脂水分配系數的變化趨勢一致。從表3中可以看出，靜電作用和非靜電作用共同決定了配合物的水溶性，當在TDD分子上的N原子引入一個乙撐哌啶基后，分子的極性增加，偶極矩由11.27變化為12.46，這有利于配合物在水中的溶解。但由于增加了一個大的修飾基，使形成空穴的能量增大，從156.86 MJ／mol變為210.26 MJ／mol（37.49～50.22 kcal／mol），從而降低了水溶性。多種貢獻的總體決定了188Re-N-NEPTDD的水溶性比188Re-N-TDD的差。繼續在哌啶環上增加甲基，對分子的極性幾乎沒有影響，靜電對水溶性的影響不大，同時由于分子體積的增加，使形成空穴所需的能量變大，因此總體上增加了配合物的水溶性。

表4 188 Re（Ⅴ）-N-配合物水溶劑化自由能結果

3 結 論

利用改進的［188Re N］int2＋中間體制備方法和配體交換法制備了四個188Re（Ⅴ）-N-TDD類配合物，建立了HPLC和TLC分析測定方法，測定了穩定性和脂水分配系數等參數。

B3LYP計算結果能夠對此類配合物的結構和成鍵進行預測。使用PCM模型計算獲得了配合物的水溶劑化自由能。構效關系研究表明，溶劑化自由能變化和脂水分配系數有相同的變化趨勢，通過預先的理論計算能夠對配合物性質定性預測，對該類化合物的設計提供幫助。

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