實驗性糖尿病鼠大血管病變TGF-β1和CTGF的表達及中藥的干預作用*

王 軍，徐 陽，袁向科，張學勇，丁志明

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

實驗性糖尿病鼠大血管病變TGF-β1和CTGF的表達及中藥的干預作用*

王 軍，徐 陽，袁向科，張學勇，丁志明

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

[目的]通過觀測實驗性糖尿病鼠大血管病變中轉化生長因子（TGF-β1）和結締組織生長因子（CTGF）相關表達，揭示糖尿病大血管病變的發病機制。并通過中藥干預的觀察，明確中藥在預防和治療糖尿病大血管病變的靶點。[方法]雄性SD大鼠80只，其中正常對照組10只，70只造糖尿病模型并隨機分為5組：模型組（n=14），中藥高、中、低劑量組（n=14），二甲雙胍組（n=14）。6組大鼠均予普通飼料加干預喂養12周后，取股動脈，應用免疫組化法觀察糖尿病（DM）大鼠大血管中CTGF、TGF-β1表達的部位及其變化。[結果]TGF-β1主要在胞漿中表達。模型組TGF-β1表達呈強陽性反應，中藥干預組TGF-β1表達明顯下降（P＜0.01），二甲雙胍對TGF-β1表達有影響，但與中藥高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。C TGF在模型組血管管壁下層細胞漿可見大量棕黃色物質表達呈強陽性反應，各藥物干預組血管細胞CTGF表達都明顯下降（P＜0.01），中藥高劑量組與西藥對照組表達比較差異有統計學意義。[結論]1）糖尿病大血管病變可能與纖維化有關。2）中藥組方加味桃核承氣湯能有效降低致纖維化因子TGF-β1、CTGF在實驗性糖尿病鼠大血管病變中的表達。其對DM大血管病變有改善作用，并存在劑量依賴關系。

2型糖尿病；大血管病變；纖維化；中藥；結締組織生長因子；轉化生長因子-β1；免疫組化

大血管病變是糖尿病（DM）常見的并發癥之一，是糖尿病患者致殘和致死的最主要原因之一。糖尿病血管并發癥的發病機制存在多種學說，目前公認的主要有糖基化終末產物（AGEs）學說和氧化應激等學說。筆者在前期研究中發現：糖尿病患者截肢標本中，血管病變是以內膜的纖維性增厚為主，僅有極少部分患者出現粥樣硬化斑塊，而且脂質沉積特點與單純動脈粥樣硬化并不相同，纖維成分所占比例大，在電鏡下也看到同樣的結果。既往現代醫學對于糖尿病大血管并發癥研究和治療都是基于動脈粥樣硬化角度的，對于其纖維化病變都未予重視，認為有可能從膠原纖維沉積的角度突破，以便更好的揭示糖尿病動脈損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠80只，清潔級，2月齡，體質量200～250 g，由天津實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗藥物 加味桃核承氣湯（桃仁10 g，大黃 6 g，桂枝 6 g，甘草 3 g，芒硝 6 g，黃芪 30 g，生地15 g，麥門冬12 g，玄參12 g），減壓濃縮至濃度為0.76 g/mL，大鼠用藥劑量為生藥6.07 g/（kg·d）。由天津中醫藥大學第一附屬醫院制劑室按水煎醇沉工藝制備，4℃冰箱保存備用。

鹽酸二甲雙胍片：0.25 g/片，100片/瓶，天津太平洋制藥有限公司生產，藥品研碎與生理鹽水配成0.1%的溶液。成人推薦劑量為1.5 g/70（kg·d），大鼠相當于人的等效劑量為0.14 g/（kg·d）。

生理鹽水：天津大冢制藥有限公司生產。

精蛋白鋅胰島素注射液：400U/瓶。由江蘇萬邦生化醫藥有限公司生產。

1.1.3 實驗儀器 血糖儀：德國羅氏活力型血糖儀。顯微鏡：日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11。多功能真彩色細胞圖像分析管理系統：美國Media Cybernetics公司Image-ProPlus。切片機：德國萊卡RM2015。離心機：北京離心機廠LDZ5-2型。

1.1.4 實驗試劑 SP免疫組化試劑盒：購自北京中杉金橋生物技術有限公司。濃縮型DAB顯色劑試劑盒：購自北京中杉金橋生物技術有限公司。多聚賴氨酸：美國SANTA CRUZ公司。兔抗鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1）多克隆抗體：美國 SANTA CRUZ公司。枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）：由天津市南開醫院病理室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 正常對照組（n=10，A組），造模成功的70只大鼠采用隨機數字表法隨機分為5組：糖尿病模型組（n=14，B組），糖尿病+加味桃核承氣湯高劑量治療組（n=14，C組），糖尿病+加味桃核承氣湯中劑量治療組（n=14，D組），糖尿病+加味桃核承氣湯低劑量治療組（n=14，E組），糖尿病+二甲雙胍治療組（n=14，F組）。大鼠非禁食狀態下血糖維持在25mmol/L。

1.2.2 實驗干預 5組大鼠全部予普通飼料喂養，每日給予適量長效胰島素皮下注射，前5周每周2次尾靜脈取血測血糖，后7周每周1～2次監測血糖，B、C、D、E、F 組維持非禁食狀態血糖 25mmol/L。

同時，A組和B組給予0.9%生理鹽水10mL/kg灌胃，每日 1次，C、D、E 組按 10、7.5、5mL/kg給予中藥灌胃，每日1次，F組以二甲雙胍0.14 g/（kg·d）溶于10mL生理鹽水中灌胃。

1.3 檢測分析

1.3.1 觀察指標 TGF-β1、結締組織生長因子（CTGF）。

1.3.2 取材 按照上述方法飼養大鼠12周后，禁食24 h后，用10%的水合氯醛3 g/k g，麻醉，仰臥位固定大鼠,備皮、消毒、鋪巾。沿股動脈走向縱向切開皮膚,用蚊式鉗鈍性分離組織，以暴露股動脈鞘，其中呈粉紅色且觸之有搏動的粗大血管即為股動脈。用眼科鑷鈍性分離截取股動脈約4～5 cm。PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，經70%～100%乙醇各30min共8次，二甲苯透明30min兩次沖洗，55℃石蠟中30min兩次，用銅制模具包埋組織塊；將厚度5μm的組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜備用。

1.3.3 標本TGF-β1免疫組化檢測 1）脫蠟、入水：將切片浸于二甲苯中5min兩次、100%～75%乙醇5 min共8次，再以自來水沖洗、PBS洗兩次。2）1%甲醇雙氧水、0.1mol/LPBS洗。3）滴加抗原修復液，0.1mol/LPBS洗。4）滴加正常山羊血清封閉液不洗。5）滴加第一抗體，4℃過夜，0.1mol/L PBS洗 3次。6）滴加生物素化第二抗體（IgG），37 ℃ 20 min，0.1mol/LPBS洗3次。7）滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃ 20min，0.1mol/L PBS洗3次。8）D AB顯色：使用DAB顯色試劑盒1mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本上，顯色6min，充分水洗。9）蘇木素復染細胞核中性樹脂封片。

鏡觀采相分析：以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統，每張切片在高倍鏡下（×400）隨機選取10個視野并攝像保存，采用IMAGE PRO PLUS軟件設置陽性表達的宏程序，在同一條件下，分析不同組別的TGF-β1含量，對陽性表達率進行組間比較。

1.3.4 標本CTGF免疫組化檢測 所用載玻片均經多聚賴氨酸處理，連續切片厚4μm，一抗為兔抗CTGF和兔抗TGF-β1多克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG，以0.01mol/LPBS代替一抗作陰性對照。具體步驟如下：1）石蠟切片厚4μm，常規脫蠟，置于3%過氧化氫甲醇溶液中，封閉內源性過氧化物酶活性。2）蒸餾水沖洗，采用微波修復法進行抗原修復。3）PB S洗，加入正常山羊血清，37℃，30min，封閉內源性生物素；甩掉血清，加一抗。4）PB S沖洗，5min，3次；滴加二抗（均為生物素標記羊抗兔IgG），37 ℃，25min。5）PB S 沖洗，5min，3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素（SP），37℃，20min。6）PB S 沖洗，5min，4 次。7）用新鮮配制的 DAB-H2O2液顯色，光鏡下觀察并控制顯色程度；蒸餾水沖洗，終止顯色。8）蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片，光鏡觀察，陽性部位呈棕黃色。

免疫組化結果用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統分析3組大鼠CTGF的靜態灰度值。CTGF的表達強度與測得的灰度值呈負相關。

1.4 統計學方法 所有數據用SPSS 19.0處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

整個實驗過程順利，各組死亡大鼠：A組1只、B組1只、C組5只、D組3只、E組3只、F組2只。故至實驗結束時各組實驗大鼠數量為：A組（n=9）、B 組（n=13）、C 組（n=9）、D 組（n=11）、E 組（n=11）、F組（n=12）。各項實驗結果分析如下。

2.1 各組大鼠血糖比較 實驗結束時，各糖尿病大鼠（B、C、D、E、F 組）血糖比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組股動脈TGF-β1、CTGF表達水平 見表1。與正常對照組比較，糖尿病模型組CTGF、TGF-β1均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與正常對照組比較各治療組，CTGF、TGF-β1均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；各中藥治療組與糖尿病模型組比較，CTGF、TGF-β1均降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與糖尿病模型組比較，西藥組 CTGF、TGF-β1 均降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與西藥組比較中藥高劑量組，CTGF、TGF－β1均有降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠股動脈中CTGF、TGF-β1的表達水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

表1 各組大鼠股動脈中CTGF、TGF-β1的表達水平（±s）Tab.1 Theexpression levelsof CTGF and TGF-β1 in arteria cruralisof rats in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 n CTGF TGF-β1正常對照組 9 1.45±0.16 12.47±2.83 DM 模型組 13 6.11±0.67** 43.25±3.16**加味方高劑量組 9 2.86±0.30*▲▲ 16.42±1.68*▲▲加味方中劑量組 11 3.14±0.12*▲ 24.74±2.53*▲加味方低劑量組 11 3.62±0.21*▲ 31.86±4.39*▲二甲雙胍治療組 12 3.29±0.30*▲ 28.75±4.55*▲

2.3 各組大鼠免疫組化圖像觀察及分析 CTGF：正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質，呈弱陽性改變；模型組血管黏膜下層細胞漿可見大量棕黃色物質表達呈強陽性反應，治療組血管細胞CTGF表達都明顯下降（P＜0.01），其中，中藥高劑量組與西藥對照組表達有差別，且差異有統計學意義。

TGF-β1：TGF-β1主要在胞漿中表達。正常對照組大鼠胞漿有散在黃色物質，呈弱陽性改變；模型組TGF-β1表達明顯多的棕黃色顆粒物質，呈強陽性反應，治療后，與造模組比較，中藥組TGF-β1表達明顯下降（P＜0.01），二甲雙胍對 TGF-β1表達有影響，與中藥中劑量組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與中藥高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

血管壁纖維化，作為糖尿病的主要并發癥，表現在過量的細胞外基質的沉積導致血管管腔直徑的縮小及動脈壁的增厚。研究發現TGF-β及其信號轉導通路在血管纖維化中起著重要作用，并與CTGF有著密切聯系。

TGF-β對于基質蛋白聚集和膠原纖維沉積具有重要調節作用，TGF-β在細胞外基質沉積過程中在減少基質降解酶及增加降解抑制劑合成的同時，還促進成纖維細胞增殖，在多種組織器官纖維化發展中起關鍵作用[1]。近年來，越來越多的研究已經提出以TGF-β1為靶目標抗纖維化。通過消除纖維化發展過程中病變組織產生的過多TGF-β1來預防或阻斷纖維化的發展已成為纖維化防治研究的最新熱點[2]。結締組織生長因子是一種屬于CCN家族的生長因子，是與組織纖維化密切相關的促纖維化細胞因子。正常生理情況下，其在維持正常細胞和結締組織功能中具有至關重要的作用，它還在一些疾病引起的組織損傷修復及血管形成中起重要作用[3]。病理情況下，CTGF過度表達與某些增生性或纖維化疾病的發生發展密切相關[4]。研究表明，CTGF能夠直接誘導結締組織細胞增殖和細胞外基質（ECM）合成，是可以刺激成纖維細胞增殖和ECM沉積的生長因子[5]。CTGF生物學效應相對單一，多在TGF－β下游起作用，能特異性介導TGF-β1促細胞增殖、促進組織器官纖維化和ECM合成。CTGF是TGF-β1誘導組織纖維化的下游成分，CTGF啟動子中包含了TGF-β1的反應元件（T RE/BCE-1），TGF-β1可促進CTGF表達上調[6]。CTGF與TGF-β共同作用能促進慢性纖維化，許多纖維化疾病都存在TGF-β與CTGF的高表達。CTGF能有效促進血管生成、細胞趨化及誘導細胞外基質生成，在多種組織細胞都有其表達，其中包括血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及成纖維細胞。有研究表明，CTGF可參與血管的損傷修復，可直接誘導結締組織細胞增殖和細胞外基質合成，與血管纖維化密切相關[7]。

中醫對糖尿病血管并發癥病機的認識，主要是本虛標實論、從瘀論、從脾論和從肝論，最有代表性是本虛標實論和從瘀論[8]。王憶黎[9]認為本病的病機以標本虛實為主線，圍繞虛、瘀、痰、毒4個環節。本虛主要有脾氣虛、腎陰不足、脾腎兩虛、甚至陰陽兩虛，而瘀、痰、毒則是構成標實的基本要素。吳深濤[10]認為消渴病與其并發癥實質上是由虛致實，又因實致虛的相對的因果關系。但大多認為本病氣陰兩虛為本，痰濁瘀血為標，互為因果惡性循環，致使糖尿病血管病變進行性發展加重。因此益氣養陰、活血化瘀是治療糖尿病血管并發癥的常用大法。用于瘀熱互結的經方桃核承氣湯伍以益氣養陰藥而成的加味桃核承氣湯既往有研究表明在防治糖尿病血管并發癥上有很好的作用[11]。通過本研究證實其能有效降低致纖維化因子TGF-β1、CTGF在實驗性糖尿病鼠大血管病變中的表達，其對DM大血管病變有改善作用，并存在劑量依賴關系。這為今后的研究以及防治糖尿病血管病變提供一條新途徑。

[1]Gressner AM,Werskirchen R.Morden pathogenetic conceptsof liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-βasmajor players and therapeutic targets[J].JCellMolMed,2005,10(1):76-99.

[2]Le Bousse-Kerdilès MC,MartyréMC,Samson M.Cellular and molecularmechanismsunderlying bonemarrow and liver fibrosis:a review[J].Eur CytokineNetw,2008,19(2):69-80.

[3]DeWinter P,Leoni P,Abraham D.Connective tissue growth factor:structure-fuction relationship ofamosaic,multifuctiongnalprotein[J].Growth factors,2008,26(2):80-91.

[4]Shi-Wart X,Leask A,Abrahan D.Requlation and function of connective tissue growth factor/CCN2 in tissue repair,scarring and fibrosis[J].Cytokine Growth Factor Rev,2008,19(2):133-144.

[5]Cicha I,Yilmaz A,Klein M.Connective tissue growth factor is over expressed in complicated atherosclerotic plaques and induces mononuclear cell chemotaxis in vitro[J].Arterioscler Tliromb Vase Biol,2005,25(5):1008-1013.

[6]Reem AK,Mohammad A,Sameer MA,etal.The role of connective tissue growth factor in skeletal growth and development[J].Med Sci Monit,2006,12(12):RA277-281.

[7]Hughes JM,Kuiper EJ.Advanced glycationend products cause increased CCN family and extracellularmatrix gene expression in the diabetic rodent retina[J].Diabetologia,2007,50(5):1089-1098.

[8]劉 椏，康 健，陳 敏.糖尿病大血管疾病因病機及證治研究進展[J].天津中醫藥，2009，26（5）：438-440.

[9]王憶黎.2型糖尿病虛瘀痰毒病機及治療探討[J].四川中醫，2002，20（7）：16.

[10]吳深濤.糖尿病慢性并發癥的中醫治療[M].天津：天津科學出版社，2000：5.

[11]Saimei L,Manqi X,Anzhong L,et al.Comparative study on effects of differents in preventingmyocardial ischemia caused by coronary artery ligation in diabetic rats[J].Chinese Journal of Integrated TraditionalandWestern Medicine,2000,6(4):290.

Expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy and intervention role of traditionalChinesemedicine

WANG Jun,XUYang,YUANXiang-ke,ZHANGXue-yong,DINGZhi-ming
（Th e FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chi na）

[Objective]To explore the pathogenesismechanism ofmacroangiopathy in diabetic patients trough observing the expression of TGF-β1 and CTGF in ratswith experimental diabeticmacroangiopathy and decide the target in preventing and treating themacroangiopathy in patientswith diabetes through observing the preventing effectof TCM.[Methods]Among eightymale SD rats seventywere induced with diabetes(DM).They were divided into 5 groups:model group(n=14),high,medium and low dose of traditional Chinese medicine groups(n=14),melbine group(n=14).All rats in these six groupswere givingwith ordinary feed for12 weeks.After that,arteria cruraliswasobtained and the site and change ofexpression ofCTGFand TGF-β1 in which were observed.[Results]TGF-β1wasmainly expressed in the cytoplasm.It is strong positive inmodelgroup.In Chinesemedicine intervention groups the expression of TGF-β1 was declined obviously(P<0.01).Melbine has influence on the expression of TGF-β1,but the comparison with high dose of traditional Chinesemedicine group has significantdifference(P<0.05).A large ofbrown-1yellowmaterialwith strong positive reaction(CTGF)could be seen in cytochylema in submucosa ofblood vesselsofmodelgroup.But the CTGFexpressionwasallsignificantly lowered in cellofblood vessels in drug intervention groups(P<0.01).The difference ofexpression between high dose group and Westernmedicine controlgroup was statistically different.[Conclusion]1）The onsetofdiabetic angiopathymay be concerned with fibrosis.2）Modified Taohe Chengqi Decoction can reduce the expression of Fibrosis factor TGF-β1 and CTGF in ratswith experimentaldiabeticmacroangiopathy.Itcan improvemacroangiopathy in DM and hasa dose-1dependent relationship.

diabetesmellitus 2macroangiopathy;macroangiopathy fibrosis;traditionalChinesemedicine;CTGF;TGF-β1;immunohistochemistry

R587.2

A

1672-1519（2012）03-0266-04

天津市應用基礎研究計劃項目（09JCYBJC12500）。

王 軍（1962-），女，博士，主任醫師，教授，主要從事中醫糖尿病足與周圍血管病相關研究工作。

2012-04-22）