心肌微環(huán)境下丹酚酸B誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究*

張云莎，薛 亮，范英昌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

心肌微環(huán)境下丹酚酸B誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究*

張云莎1，薛 亮2，范英昌1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

[目的]復(fù)制心肌缺血-再灌注損傷模型，體外模擬心肌缺氧復(fù)氧微環(huán)境，觀察丹酚酸B（SalB）誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向心肌樣細(xì)胞分化的作用。[方法]通過向MSCs培養(yǎng)體系中添加心肌細(xì)胞裂解液的方法，體外模擬心肌微環(huán)境。自成年大鼠骨髓中分離MSCs，設(shè)對照組（A組）、心肌細(xì)胞裂解液（TJ）組（B組）、SalB組（C組）、TJ+SalB組（D組）。培養(yǎng)4周，觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用免疫熒光技術(shù)檢測cTnT的表達(dá)。[結(jié)果]除A組MSCs無明顯的肌樣細(xì)胞形成，各誘導(dǎo)組均有肌樣細(xì)胞分化，D組與C組相比，cTnT表達(dá)率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)論]心肌細(xì)胞裂解液可以誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化；心肌微環(huán)境的建立有利于SalB誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌樣細(xì)胞；丹酚酸B；心肌微環(huán)境

在組織工程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）作為一種重要的種子細(xì)胞引起人們越來越多的關(guān)注，其中因能分化為心肌樣細(xì)胞備受關(guān)注[1]。但單純依賴MSCs移植，分化為心肌樣細(xì)胞的數(shù)量有限，難以起到代償作用。因此，如何提高M(jìn)SCs的分化率是細(xì)胞移植的關(guān)鍵。筆者前期研究表明，中藥單體丹酚酸B（SalB）可以誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，但單純的SalB對MSCs的誘導(dǎo)率有待提高。移植細(xì)胞所處的微環(huán)境是影響MSCs分化的重要因素，本實驗將制備缺氧復(fù)氧心肌裂解液體外模擬心肌缺血再灌注的微環(huán)境，觀察SalB對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SD成年大鼠及乳鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（京）2005-0001；DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Gibco公司）；Percoll’s細(xì)胞分離液（Pharmacia公司）；cTnT抗體（Santacruze公司）；FITC連接的兔抗山羊IgG（Santacruze公司）；0.1%Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（S igma公司），4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI，S igma公司），Triton－X－100（AMRESCO公司）；BrdU（上海浩然生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞裂解液（條件培養(yǎng)液）的配置

1.2.1.1 心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[2]，無菌操作下取乳鼠心臟，留心尖部，經(jīng)過漂洗，剪切，胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化，加含10%胎牛血清預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化后，收集上清液，200目的尼龍網(wǎng)篩過濾去除殘留組織塊，離心獲得的細(xì)胞與培養(yǎng)液混懸后，采用差速貼壁分離法去除心肌成纖維細(xì)胞，將未貼壁的心肌細(xì)胞懸液吸出，調(diào)整細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中。培養(yǎng)前3 d加入0.1mmol/L BrdU抑制成纖維細(xì)胞生長[3]。48 h首次換液，以后根據(jù)情況2～3 d換液。

1.2.1.2 缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞裂解液的配置 取培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞進(jìn)入實驗。實驗前換以無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h，使細(xì)胞生長同步化。將培養(yǎng)瓶置于95%N2+5%CO2培養(yǎng)箱，37℃恒溫，飽和濕度，持續(xù)缺氧培養(yǎng)4 h，再放置于95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧過夜培養(yǎng)。次日，將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，迅速置于-70℃冰箱中，約4～5 h后取出融化，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，如此反復(fù)3次后將細(xì)胞裂解液在2000 r/min的條件下離心10min，將上清用0.45μm的濾器過濾后備用[4]。

1.2.2 MSCs的分離與培養(yǎng) 大鼠MSCs的分離與培養(yǎng)參照前期研究所采用的方法進(jìn)行[5]。

MSCs的誘導(dǎo)分化：取生長較好的第3代MSCs做如下處理，共誘導(dǎo)4周。對照組（A組），MSCs僅在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；心肌細(xì)胞裂解液組（B組），MSCs培養(yǎng)體系中加入50%的心肌細(xì)胞裂解液，隔日換液，每次換液均加入相同量的心肌細(xì)胞裂解液；SalB組（C組），MSCs培養(yǎng)體系中加入16mg/L的SalB孵育24 h后，換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液；TJ+SalB組（D組），MSCs培養(yǎng)體系中加16mg/L的SalB孵育24 h后，換含50%心肌細(xì)胞裂解液培養(yǎng)液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.3 誘導(dǎo)后MSCs的cTnT蛋白免疫熒光表達(dá)檢測 按上述實驗分組給予不同處理后棄除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，以預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，0.5%Triton-X-100穿孔15min。10%正常兔血清封閉30min后，加入一抗cTnT（1∶100稀釋）4℃過夜，再加兔抗羊 FITC-IgG室溫孵育2 h，DAPI復(fù)染核5min，甘油封片，熒光顯微鏡激發(fā)照相。然后用共聚焦顯微鏡將“DAPI”與“FTIC”圖像合成。若觀察到雙陽性細(xì)胞即胞核呈藍(lán)色熒光胞漿呈綠色熒光，則提示MSCs向心肌樣細(xì)胞發(fā)生了定向分化。

每組隨機(jī)選取8張染色的細(xì)胞爬片，于200倍鏡下每張片選5個不同的視野，數(shù)碼相機(jī)拍攝后，計數(shù)陽性細(xì)胞率。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài) 在倒置相差顯微鏡下觀察，剛分離的心肌細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)2 h后成纖維細(xì)胞基本完全貼壁，而少數(shù)心肌細(xì)胞8 h左右開始貼壁，少數(shù)貼壁的單個心肌細(xì)胞出現(xiàn)了自發(fā)性搏動，搏動的頻率、節(jié)律各不同。24 h后搏動的心肌細(xì)胞百分率大約為50%，搏動頻率較分散，約30～50次/min。至48 h視野下細(xì)胞呈梭形，板形，三角形或扁平不規(guī)則形，折光度較高，細(xì)胞中隱約可見細(xì)胞核，搏動的心肌細(xì)胞百分率大于90%，搏動頻率多集中在50～80次/min，72 h后細(xì)胞充分鋪展，貼壁牢固，少數(shù)局部均一搏動頻率，可達(dá)80～100次/min。

2.2 MSCs形態(tài) 原代細(xì)胞接種24 h后，培養(yǎng)瓶底即出現(xiàn)少許貼壁細(xì)胞，多呈紡錘形或梭形，有少量細(xì)胞已開始增殖，成纖維細(xì)胞樣，聚集生長，少有單個分散狀態(tài)。隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細(xì)胞明顯增多，集落逐漸增大，呈放射狀排列。傳代細(xì)胞密度分布均勻，細(xì)胞生長也均勻一致。

2.3 MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)觀察 A組無肌樣細(xì)胞出現(xiàn)。B組MSCs在心肌細(xì)胞裂解液的作用下，有聚集生長的趨勢，可見大量成片的肌樣細(xì)胞及圓形的子代細(xì)胞。C組細(xì)胞生長狀態(tài)較好，脫壁或降解的細(xì)胞數(shù)量少，隨著誘導(dǎo)時間的推移，部分視野形成肌絲樣結(jié)構(gòu)。D組細(xì)胞有聚集生長的趨勢，隨著時間的推移，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，排列具有方向性，部分視野可以觀察到明顯的肌絲樣結(jié)構(gòu)。

2.4 誘導(dǎo)后MSCs的cTnT蛋白免疫熒光表達(dá) 除對照組組外，各誘導(dǎo)組cTnT均有一定程度的表達(dá)；與C組相比，D組cTnT的表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表 1，圖 1。

表1 各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT陽性表達(dá)率（±s）Tab.1 Positive cTnT expression rateofM SCs in each group（±s）%

表1 各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT陽性表達(dá)率（±s）Tab.1 Positive cTnT expression rateofM SCs in each group（±s）%

注：D組與C組比較，*P<0.05。

組別 n 陽性表達(dá)率A 8 0 B 33.72±9.74 C 8 15.63±2.28 8 D 835.34±7.66*

3 討論

由于MSCs向特定細(xì)胞分化的能力受局部微環(huán)境的調(diào)控，而單純藥物刺激難以模擬體內(nèi)微環(huán)境，目前認(rèn)為，在體外通過成體干細(xì)胞與目的細(xì)胞共培養(yǎng)能在一定程度上“再現(xiàn)”體內(nèi)微環(huán)境并成功誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化。原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞與MSCs接觸是促進(jìn)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的重要因素，兩種細(xì)胞間的接觸通訊使MSCs接受了向心肌方向定向分化的特異性信號。因此有研究認(rèn)為干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞時可能主要受3個因素的影響：干細(xì)胞與心肌細(xì)胞間的物理接觸；心肌細(xì)胞單獨分泌化學(xué)信號；干細(xì)胞與心肌細(xì)胞接觸后心肌細(xì)胞分泌化學(xué)信號。近幾年，通過向MSCs培養(yǎng)體系中添加心肌細(xì)胞裂解液，體外模擬心肌微環(huán)境，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞表達(dá)了α-肌動蛋白、心臟特異性肌鈣蛋白T(cTnT)、連接蛋白43及CD31。研究還發(fā)現(xiàn)單獨的心肌細(xì)胞裂解液可誘導(dǎo)MSCs表達(dá)pl受體和腦鈉素。心肌細(xì)胞在缺血缺氧的情況下，能調(diào)動其應(yīng)激機(jī)制，分泌多種細(xì)胞因子[4]。曾俊義[6]則采用自體心肌勻漿上清液誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，持續(xù)作用2周，研究發(fā)現(xiàn)心肌勻漿上清液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向心肌樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)的作用。實驗結(jié)果證實，干細(xì)胞所處的微環(huán)境是影響其定向分化的重要因素。

丹酚酸B是治療心血管疾病常見用藥丹參的主要有效成分，動物實驗表明SalB具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用[7]，并對大鼠急性心肌缺血具有保護(hù)作用[8]。冉玉琴等[9]則從電生理學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)SalB通過調(diào)節(jié)鉀離子和鈣離子的流動達(dá)到抗心律失常的功效。除了給與中藥改善心功能外，移植骨髓干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞是治療缺血性心臟病的新希望，筆者的前期研究[5，10]表明，SalB能誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，但誘導(dǎo)率有待提高。

本研究采用的心肌細(xì)胞裂解液是通過將新生大鼠的心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后反復(fù)凍融裂解離心、過濾得到的，一定程度上“再現(xiàn)”了心肌缺血再灌注損傷，模擬了體內(nèi)心肌微環(huán)境。本實驗證實心肌細(xì)胞裂解液可以誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，并且發(fā)現(xiàn)在模擬的心肌微環(huán)境下，中藥單體SalB對MSCs的誘導(dǎo)率明顯提高，這對于體內(nèi)移植MSCs同時給予中藥干預(yù)的缺血性心臟病患者來說是一可喜的現(xiàn)象。

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[2]何 偉，張明雪，閆麗娟.乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)概要[J].實用心腦肺血管病雜志，2009，17（3）：339－340.

[3]MiragoliM,GaudesiusG,Rohr S.Electrotonicmodulation of cardiac impulse conduction by myofibroblasts[J].Cirac Res,2006,98(6):801-810.

[4]呂學(xué)詳，曾秋棠.心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化作用[J].臨床心血管病雜志，2008，16（2）：217－219.

[5]徐秀梅，郭茂娟，趙 旭，等.丹酚酸B體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（3）：574－576.

[6]曾俊義，魏云峰，汪 泱，等.人類心肌勻漿上清液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及相關(guān)基因時序表達(dá)的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（23）：4181－4185.

[7]王保和，傅 偉.丹酚酸B對急性心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌保護(hù)作用的機(jī)制研究[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，23（3）：12－15.

[8]胡旭光，相 湘，楊超燕，等.丹酚酸B對實驗性大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（3）：334－336.

[9]冉玉琴，李 寧，王蓉蓉，等.丹酚酸B對大鼠心室肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流和L型鈣電流的阻滯作用[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2010，24（4）：344－348.

[10]華聲瑜，范英昌，馬鐵文，等.丹酚酸B對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中Desmin、α-actinmRNA表達(dá)的影響[J].天津中醫(yī)藥，2009，26（2）：145-148.

Study on differentiation ofmesenchymalstem cells into cardiomyocyte-like cells induced by SalB in cardiacm icro-environment

ZHANGYun-sha1,XUE Liang2,FANYing-chang1
（1.PathologicalStaffRoom,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.College of Tradition ChineseMedicine,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Ch in a）

[Objective]To reproduce themodelofmyocardial ischemia-reperfusion injury to simulate cardiacmicro-environment in vitro and observe the effectSalB in the process ofmesenchymalstem cells(MSCs)differentiating into cardiomycyte-like cells.[Methods]A myocardium micro environmentwas simulated in vitro by addingmyocardial cell lysate to MSCs culture system.MSCswasobtained from adult rats'bonemarrow,and divided into four groups:the controlgroup(group A),myocardio cell lysate group(TJ,group B),SalB group(group C)and TJ+SalB group(group D).They were cultivated for fourweeks,and then themorphology was observed and the cTnT expressionwasdetected by immune fluorescence detection technology.[Results]Each induced group hadmyocardial-like celldifferentiation exceptgroup A.Compared with group C the cTnTexpression in Group Dwas themostobviouswith a statisticalsignificance between them.[Conclusion]Myocardial cell lysate can induceMSCs differentiating into cardiomyocyte-like cells.Cardiacmicro-environmentcan contribute SalB to induce differentiation ofMSCs into cardiomyocyte-like cells.

mesenchymalstem cells;cardiomyocyte-like cells;SalB;cardiacmicro-environment

R542.2

A

1672-1519（2012）03-0278-03

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（201012 10110004）；天津市自然科學(xué)基金項目（09JCYBCI12200）。

張云莎（1984-），女，碩士，助教，研究方向為中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。

范英昌。

2011-12-22）