應用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)研究三七總皂苷與冰片的配伍規(guī)律*

顧 慧 ，馬葉濤 ，尋明金，時曉燕 ，何 新 ，2

（1.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193；2.天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193）

應用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)研究三七總皂苷與冰片的配伍規(guī)律*

顧 慧1，馬葉濤1，尋明金1，時曉燕1，何 新1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193；2.天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193）

[目的]以三七總皂苷（PNS）中3種主要活性成分人參皂苷Rg1（Rg1）、人參皂苷Rb1（Rb1）和三七皂苷R1（R1）為質控成分，應用藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDAS S）研究PNS與冰片配伍前后的腸透過規(guī)律，并探討其吸收機制，以期將該系統(tǒng)用于創(chuàng)新中藥開發(fā)和處方篩選，為傳統(tǒng)中藥研究提供新的方法。[方法]建立同時測定PNS中Rg1、Rb1和R1的高效液相色譜（HPLC）方法；應用DDASS法，考察PNS與冰片配伍前后3種成分的腸累積透過量（Qt）及表觀滲透系數（Papp）的變化；SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。[結果]PNS單用時Rg1、Rb1和R1的Papp值分別為（0.49±0.09）cm/秒、（0.07 ±0.03）cm/秒、（0.58±0.04）cm/秒；PNS 與冰片配伍后 Rg1、Rb1和 R1的 Papp分別為（1.17±0.08）cm/秒、（0.16±0.02）cm/秒、（1.57± 0.50）cm/秒，分別是單用PNS的2.4、2.2和 2.7倍；而與外排轉運蛋白 P-糖蛋白（P-gp）抑制劑環(huán)孢素 A（CsA）合用時，這 3種成分的 Papp值分別為（0.62 ± 0.09）cm/秒、（0.12 ± 0.04）cm/秒、（0.90 ±0.26）cm/秒，與PNS單用組均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。[結論]PNS中Rg1、Rb1和R13種成分均為低滲透性成分；冰片可顯著提高PNS的Qt和Papp，促進其口服吸收；CsA對PNS的Qt和Papp沒有顯著影響，推測Rg1、Rb1和R1不是P-gp的底物，冰片提高其Qt和Papp可能主要受細胞旁路機制影響。

人參皂苷 Rg1；人參皂苷 Rb1；三七皂苷 R1；藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDASS）；表觀滲透系數（Papp）

藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（DDASS）是近幾年發(fā)展起來的連續(xù)動態(tài)評價藥物溶出和跨膜透過特征的新型評價技術[1-4]。2003年He等[3]將該體系用于解析經口投藥后藥物的崩解、溶出和膜透過規(guī)律；2004年He等[4]建立了不同的胃酸模型，研究不同胃酸情況下對制劑的藥物溶出率和跨膜吸收率的影響。在此基礎上本課題組對該體系進行了改進，成功用于評價丹酚酸B緩釋片的釋藥規(guī)律[5]以及單硝酸異山梨酯4種不同制劑的釋藥規(guī)律及體內外相關性研究[6]。本文采用新型藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)探討復方丹參方中三七總皂苷（PNS，以Rg1、Rb1和R1為檢測成分）與冰片配伍前后的跨膜透過性、吸收機制等，為創(chuàng)新中藥研究提供一種新技術和新方法，提高新藥研發(fā)的成藥性。此前有采用大鼠在體單向灌流模型[7]、大鼠不翻轉腸囊模型[8]、Caco-2細胞模型[9]、體內動物吸收模型[10]等不同方法對傳統(tǒng)藥方復方丹參方中PNS或PNS與冰片的配伍對進行膜透過性、吸收機制等研究的報告，為驗證DDASS方法提供了可行性。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 三七總皂苷（人參皂苷Rg1>20%、人參皂苷Rb1>30%、三七皂苷R1>5%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110745200702，純度98%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704200921，純度 92.6%）、三七皂苷 R1對照品（批號：110704200921，純度 98%）、冰片（批號：1107432200904）、環(huán)孢素 A（CsA）對照品（批號：30495200202），均購自中國藥品生物制品檢定所；水為純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體質量（250±20）g，購買于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，動物合格證號：SYXK（津）2009-0001。在（25±2）℃，相對濕度45%～65%，光照/黑暗為12 h/12 h條件下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 儀器

1.3.1 主要儀器 Merrler Toledo AX205十萬分之一天分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；Waters600E自動型高效液相儀（美國Waters公司）；PHSJ-4A型實驗室pH計（上海精密科學儀器有限公司）；Tomos Model2-16A高速離心機（美國Tomos公司）。

1.3.2 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng) 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)（閉合式）如圖1所示，其核心部位由藥物溶解室和擴散池兩部分組成，藥物溶解室置一磁力攪拌子和載藥籃，出口部分安裝有不銹鋼篩網；擴散池部分，在供給室和接受室之間嵌合大鼠離體腸管，使得腸腔漿膜側為供給室，腸腔黏膜側為接受室，供給室和接受室中的介質分別是藥物溶解液（pH=6.0）和接受液（pH=7.4）。

1.4 PNS 中 Rg1、Rb1、R13 種成分 HPLC 同時測定方法

1.4.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×150mm，5 μm），以（A）乙腈和（B）水為流動相進行梯度洗脫，流動相梯度0～10min為22%（A）；10～18min 為 55%（A）；18～30min 為 22%（A）。流速：1.0mL/min，檢測波長：203 nm，柱溫：30℃，進樣量：20μL。

1.4.2 儲備液的制備 精密稱定80℃干燥至恒質量的 Rg18.06mg、Rb16.80mg、R16.72mg 對照品，置10mL容量瓶中，分別用甲醇制備成濃度為806、680、672μg/mL的儲備液，待用。

1.4.3 專屬性 以藥物溶解液作為空白對照樣品，用儲備液配置混合濃度的Rg1、Rb1和R1做為對照樣品，從擴散池的接收室中隨機取樣做為待測樣品。樣品分別經0.45μm的微孔濾膜過濾，按“1.4.1”項下條件測定。

1.4.4 線性范圍 將上述儲備液用流動相混合稀釋制備成一系列濃度的標準溶液，按“1.4.1”項下條件測定峰面積，以Rg1、Rb1、R1的濃度為橫坐標，以峰面積值為縱坐標進行線性回歸。

1.4.5 準確度和精密度 精密稱量Rg1、Rb1、R1對照品配制高中低3個濃度各3份，按“1.4.1”項下條件測定，準確度結果以R E（%）表示。上述溶液每日測定3次，連續(xù)測定3 d，計算日內精密度和日間精密度 RSD（%）。

1.4.6 穩(wěn)定性考察 取實驗PNS供試品溶液，按“1.4.1”項下色譜條件，分別于 0、1、2、4、6、8 h 測定室溫下樣品的峰面積，計算8h內峰面積的RSD（%）。

1.5 實驗方法

1.5.1 藥物溶出/吸收仿生系統(tǒng)法（閉合式） 腸管安裝：Wistar大鼠實驗前禁食不禁水12 h，頸動脈脫臼處死，立即沿著腹中線打開腹腔，剪下空腸（自幽門15 cm處開始）段約2 cm，放入平面皿中（內有預先氧氣飽和的接受液），小心去除腸系膜和表面脂肪，用37℃氧氣飽和接受液洗凈。用眼科剪沿腸系膜將該段腸管剖開，立刻小心安裝在擴散池中間，安裝的腸管兩側通混合氧氣（95%O2+5%CO2），整個實驗過程中保持各緩沖液溫度為37℃。

樣品采集：使用圖1裝置進行實驗，將藥物粉末加至藥物溶解室中開始實驗，溶解的藥物隨藥物溶解液流入藥物擴散池，繼而由恒速蠕動泵泵回藥物溶解室，藥物溶解液的流速由恒速蠕動泵控制在0.5mL/min；分別在 20、30、40、60、90、120、150、180、210、240min從接受室取150μL樣品，同時補充150μL空白接收液，待測樣品處理后按照“1.4.1”項下色譜條件測定。

1.5.2 實驗分組 PNS單用組：PNS原料藥投藥量為 36mg；（PNS＋冰片）組：PNS 原料藥 36mg，冰片用量 1.5mg/mL；（PNS＋CsA）組：PNS 原料藥 36mg，CsA用量0.5μg/mL。

1.5.3 數據處理

其中：Qt為藥物各時間的累積透過量；Ct為t時刻透過的藥物濃度；V為接收室中加入接收液的體積，實驗中為5.5mL[11]。

公式（2）中Qt為累積透過量；D為投藥量。

在符合漏槽條件，即供給側藥物濃度是接受測藥物濃度的10倍以上，化合物的表觀滲透系數Papp可根據如下方程計算：

公式（3）中，dQ/dt為單位時間內藥物轉運量；C0為供給池中藥物的濃度；A是轉運或擴散的表面積，本次實驗中大鼠離體小腸的表面積為（2.0×1.0）cm2；Papp單位以 cm/秒表示。

1.6 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果與結論

2.1 PNS（Rg1、Rb1、R1）HPLC 測定方法的驗證

2.1.1 專屬性 如圖2所示，藥物溶解液對PNS中3種成分色譜峰無干擾，3種成分能很好分離，互不干擾，專屬性良好。

2.1.2 線性范圍 PNS中Rg1、Rb1、R1系列濃度（X）-峰面積（Y贊）線性回歸方程見表1，表明這3種成分均呈現良好相關性。

表1 標準曲線結果Tab.1 Resultsof standard curve

2.1.3 準確度和精密度 PNS中 Rg1、Rb1、R1的準確度RE%和日內、日間精密度RSD%結果見表2，表明該方法準確度、精密度均符合要求。

表2 準確度和精密度測定結果（n＝3）Tab.2 Accuracy and precision for thedeterm ination of Rg1,Rb1,R1（n＝3）

2.1.4 穩(wěn)定性考察 PNS樣品溶液中 Rg1、Rb1、R1在不同時間點峰面積的RSD為1.34%、1.26%、1.41%，表明PNS樣品在8 h內穩(wěn)定性符合要求。

2.2 DDASS法 按“1.5.1”項下實驗法，取樣分別測得各個時間點Rg1、Rb1和R1透過濃度，按“1.5.3”項下計算其累計透過量，結果如圖3所示。

單用PNS時Rg1、Rb1和R1在DDASS體系中腸跨膜累積透過率分別是 （0.037±0.021）%、（0.032±0.010）%和 （0.011±0.003）%，均小于文獻中報道DDASS體系跨膜透過百分率的界限值0.04%[3]；計算Rg1、Rb1和R1透過大鼠離體腸管的Papp結果如表3所示，3種成分大鼠腸管的表觀滲透系數都小于界限值1×10-6cm/s[12-13]，綜上表明該3種成分滲透性差，預測三七總皂苷在體內吸收差，生物利用度低。曾昭征等[14]在復方配伍對三七總皂苷生物藥劑學性質的影響研究中也證實了這一點。

從圖3（A）可以看出PNS與冰片配伍后提高了Rg1和R1的累積透過量；表3顯示與冰片配伍后Rg1、Rb1和 R1的 Papp分別增大 2.4、2.2 和 2.7 倍，配伍組與 PNS 組比較，Rg1、Rb1、R1的 Papp值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），表明冰片對PNS中3種主要成分的吸收均有促進作用，可以提高其生物利用度。從圖3（B）可以看出PNS與CsA合用后，對3種成分的累計透過量沒有顯著影響，表3顯示PNS和CsA合用后與PNS組比較，Rg1、Rb1和R1的Papp差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明CsA對這3種成分的吸收沒有顯著性影響，推測Rg1、Rb1和R1可能不是P-gp的底物。

表3 PNS與冰片配伍及CsA干預前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

表3 PNS與冰片配伍及CsA干預前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

注：配伍組與 PNS 組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Papp×10-6（cm/秒）人參皂苷Rg1 人參皂苷Rb1 三七皂苷R1 PNS 組 0.49±0.09 0.07±0.03 0.58±0.04 PNS＋冰片組 1.17±0.08** 0.16±0.02* 1.57±0.50*PNS＋CsA 組 0.62±0.09 0.12±0.04 0.90±0.26組別

3 討論

冰片促進吸收的機制可能有2種：一是冰片有類似CsA的作用，抑制細胞膜上P-gp的活性；二是冰片可以開放細胞間緊密連接[15-16]。CsA是P-gp的強抑制劑，通過抑制P-gp轉運體的活性，從而促進P-gp底物的吸收。結合2.2分析，推測Rg1、Rb1和R1可能不受P-gp外排蛋白轉運機制影響，PNS中Rg1、Rb1和R1可能主要通過細胞旁路轉運機制被吸收。目前為止，研究者用不同的方法對PNS的藥理作用、吸收特點、配伍規(guī)律等進行了研究，其中鄧震亭等[8]用大鼠不翻轉腸囊模型對R1吸收的研究，發(fā)現R1在大鼠腸道內的吸收有被動擴散性，R1可能不是P-gp的底物；馮亮等[10]研究表明R1和Rg1在大鼠胃腸道的吸收動力學，并考察常用的吸收促進劑對其吸收速率的影響，發(fā)現卡波姆和冰片對它們在小腸的吸收有顯著促進作用；韓旻等[9]采用Caco-2細胞和動物等模型研究三七皂苷的口服吸收機制，發(fā)現三七總皂苷（包括Rb1和Rg1）的腸道吸收機制為單純被動擴散，吸收過程不受細胞膜內P-gp和MRP外排載體的調控，PNS中其他成分對Rb1或Rg1的吸收特性無明顯影響；以上結論與本實驗結果吻合，因此DDASS系統(tǒng)可以評價PNS的膜透過性及體內吸收機制。

Amidon等[1]認為藥物吸收程度受藥物跨膜透過性和溶解性兩個因素影響。體內模型存在耗時、耗力、耗資的缺點，不適合用于藥物的高通量篩選。藥典溶出實驗模型可以用于藥物體外溶出度的考察，但是不能同時評價藥物的滲透性。He等[3-4]應用DDASS模型評價了速釋制劑在體外透過-體內吸收之間的相關性，該模型不但可以同步評價固體制劑體外溶出-跨膜透過特征，而且考慮到輔料對藥物吸收的影響。本研究應用DDASS模型探討了PNS與冰片配伍的膜透過規(guī)律及吸收機制，與文獻報告的結果一致，因此DDASS系統(tǒng)可以用于中藥配伍規(guī)律及機制研究，為傳統(tǒng)中藥體內過程研究提供新技術和新方法。

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Studieson the com patibility principlesof panax notoginseng saponinswith borneolusing a novelsimulating system

GUHui1,MA Ye-tao1,XUNMing-jin1,SHIXiao-yan1,HEXin1,2
（1.Faculty ofChineseMateriaMedica,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China；2.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]The threemain componentsofpanax notoginseng saponins(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1)asquality control components,using a drug dissolution/absorption simulating system to study the change of themembrane permeability of panax notoginseng saponinsafter compatibilitywith borneoland study itspossiblemechanism.The system willbe used to study traditionalChinesemedicine,to provide a newmethod for the developmentof traditionalChinesemedicine.[Methods]HPLCmethod wasestablished todetermine the threemain constituentsofPNS(ginsenosideRg1、Rb1and notoginsenosideR1)simultaneously.DDASSwasused tostudy the changesofcumulativepermeation amountand theapparentpermeability coefficients(Papp)ofPNSaftercompatibilitywith borneol.Variance analysiswas used to analyze the differencesbetween themean values of Pappby SPSS.[Results]Pappvalues ofginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1respectivelywere(0.49±0.09)cm/s,(0.07±0.03)cm/s,(0.58±0.04)cm/s,and itwas significantly increased after compatibilitywith borneol2.4、2.2 and 2.7 times,respectively(P<0.05).The PappvaluesofRg1,Rb1 and R1 after compatibilitywith CsA were(0.66±0.07)cm/s,(0.14±0.05)cm/s,(0.92±0.27)cm/s.Therewere no significantdifference(P>0.05)compared with PNSgroup.[Conclusion]Borneolcan increase themembrane permeability of the PNS(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1),and itcan promote PNSoralabsorption and enhance itsbioavailability.CsA doesnot improve the PNSmembrane permeability.Rg1,Rb1and R1maybe notthesubstrateofP-glycoprotein.Themechanism ofenhancingpermeationbyborneolmaybe influenceby theparacellular route transport.

ginsenoside Rg1;ginsenoside Rb1;notoginsenoside R1;Drug dissolution/absorption simulating system(DDASS);permeability coefficients(Papp)

R285.5

A

1672-1519（2012）03-0284-05

教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”（PCSIRT，IRT0973）；天津市自然科學基金重點項目（12JCZDJC26100）；國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)專項（200807051）。

顧 慧（1983-），女，碩士研究生，主要研究方向為藥物代謝動力學。

何 新。

2012-04-05）