正交試驗法優選茜草配方顆粒的提取工藝

蔡樂 古今 項菲菲 劉萍

茜草為茜草科植物RubiacordifoliaL.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》，具有涼血、化瘀、止血、通經之功效，被廣泛應用于治療吐血、衄血、跌打損傷、經閉瘀阻等癥。全國幾乎都有茜草分布，其中河北、山西、山東、陜西和河南等省為茜草的主要產地[1]。其主要成分包括大葉茜草素和羥基茜草素等醌類物質。將茜草制成配方顆粒劑，取代茜草飲片，可免去患者自行煎煮的過程，方便患者使用。本文通過正交試驗對茜草配方顆粒的提取工藝進行了優選，為生產工藝參數的確定提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥

茜草飲片(由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供)經解放軍總醫院劉萍主任藥師鑒定為茜草科植物茜草(RubiacordifoliaL.)的干燥根及根莖。大葉茜草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110884-200604)；羥基茜草素(Sigma公司，批號：MKBC4162V)；乙腈、甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為重蒸餾水。

1.2 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括1200系列四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、化學工作站(美國 Agilent 公司)；Sartorius CP 225D天平等。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

配方顆粒的提取溶劑均規定為水，采用先浸泡再加熱提取的方法提取。根據預試驗的結果，以加水倍量(A)、提取次數(B)和提取時間(C)為考察因素，選取干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量為評價指標，設計正交試驗，采用L9(34)正交表優選水提茜草的最佳提取工藝條件，因素水平表見表 1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 干浸膏得率測定方法

將各次試驗提取的藥液濾過、濃縮、定容至250 ml，精密吸取10 ml置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣于105℃干燥至恒重，取出，于干燥器中放置約30分鐘至室溫后，迅速精密稱定質量并計算干浸膏得率。

2.3 大葉茜草素和羥基茜草素的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取經五氧化二磷減壓干燥12小時的大葉茜草素對照品25 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含大葉茜草素5 mg的貯備液A。精密稱取羥基茜草素10 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含羥基茜草素1 mg的貯備液B。分別精密移取50 μl貯備液A和100 μl貯備液B，置50 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含大葉茜草素和羥基茜草素分別為5 μg和2 μg的混合溶液C，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 將各次試驗提取的藥液濾過、濃縮、定容至250 ml，吸取藥液各2 ml，高速離心(10000轉/分)15分鐘，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取濾液10 μl，注入高效液相色譜儀測定大葉茜草素和羥基茜草素的含量。

2.3.3 色譜條件及適用性 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸，采用梯度洗脫的方法，0～13分鐘配比為25∶35∶40，13～15分鐘配比調整至25∶52∶23，15～35分鐘配比保持為25∶52∶23；流速：1.0 ml/min；檢測波長為250 nm；柱溫：30℃。進樣量10 μl。在此色譜條件下，羥基茜草素和大葉茜草素的保留時間分別為12.2 分鐘和30.1 分鐘左右，其他色譜峰對羥基茜草素和大葉茜草素的峰無干擾，峰形尖銳，基線平穩。色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液(a)與供試液(b)的高效液相色譜圖(Ⅰ：羥基茜草素；Ⅱ：大葉茜草素)

2.3.4 線性關系與范圍的考察 精密吸取適量貯備液A和B，加甲醇配制成含大葉茜草素和羥基茜草素濃度分別為0.5/0.4、1/0.8、2/2、5/4、10/8、20/20 μg/ml的6組標準系列溶液。分別精密吸取各濃度標準系列溶液10 μl，按上述色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標(Y)，標準系列溶液濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得大葉茜草素的回歸方程為Y=29.040X-0.6080 (r=0.9998)；羥基茜草素的回歸方程為Y=36.468X-5.2430(r=0.9999)。結果表明，大葉茜草素在0.5～20 μg/ml范圍內，羥基茜草素在0.4～20 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.1”項下混合對照品溶液C，在上述色譜條件下，連續進樣5次測定，計算大葉茜草素和羥基茜草素的峰面積RSD(n=5)分別為0.34%和0.57%，表明儀器精密度良好。

表2 正交試驗結果

2.3.6 重復性試驗 取同一批樣品，共5份，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計算大葉茜草素和羥基茜草素的峰面積RSD(n=5)分別為2.07%和2.09%，表明方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知含量的茜草干浸膏6份，每份約0.1 g，精密稱定，精密加入大葉茜草素和羥基茜草素對照品適量，加重蒸餾水定容至25 ml，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，并計算加樣回收率。大葉茜草素和羥基茜草素的平均回收率分別為102.8%(RSD=1.59%)和98.1%(RSD=1.76%)。

2.4 正交試驗方法及結果

稱取 10 g 茜草飲片共 9 份，浸泡 2小時后，采用L9(34)正交表安排試驗(表2)，微沸回流提取，制得茜草水提取液。將提取液過濾、濃縮、定容至 250 ml后，按“2.2”和“2.3”項下方法測定干浸膏得率及大葉茜草素和羥基茜草素的提取量。將干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量等3個指標轉換成相應的隸屬度，計算方法為：指標隸屬度 = (指標值-指標最小值)/(指標最大值-指標最小值)[2]，按照各指標隸屬度的權重系數(0.5∶0.25∶0.25)計算綜合評分，并對實驗結果進行分析。見表2。為進一步確定各因素對結果的影響大小，對試驗結果進行了方差分析。見表3。

表3 方差分析表

注:F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

極差分析結果表明，3個因素的影響大小依次為：提取次數(B)>加水量(A)>提取時間(C)；表3方差分析結果表明，提取次數(B)和加水量(A)2個因素對水提工藝有顯著性影響，其中提取次數(B)的影響有極顯著差異，而提取時間(C)影響較小，由此得出的最佳工藝組合為A3B3C2，即以12倍量水，煎3次，每次1.5小時，但這一組合的生產周期長、用水量大，將增加生產成本，同時也不符合節能降耗的原則。

由于提取時間這一因素對試驗結果的影響程度最小，因此考慮選取更為經濟的水平；雖然加水量因素對試驗結果的影響顯著，但通過直觀分析發現加水量為10倍量和12倍量這2個水平間的差異卻很小，在保證提取充分的前提下，考慮到縮短生產周期，降低生產成本等生產實際的需要，選擇A2B3C1組合作為水提取工藝參數，即飲片加入10倍量水，煮沸后保持微沸1小時，提取3次。

2.5 驗證試驗

為確定優選工藝的優劣和穩定性，以A2B3C1組合進行了3批驗證試驗，由表4結果可見，此工藝穩定可靠，合理可行。

表4 水煎煮提取優選工藝驗證實驗結果

3 討論

中藥配方顆粒是中藥飲片改革的一種新形式，它保持了中藥湯劑的特點，且有所專長，具有“三效”(高效、速效、長效)、“三小”(劑量小、毒性小、作用小)以及“五方便”(服用、攜帶、貯藏、組方、運輸方便)等特點[3]。近年來，中藥配方顆粒得到了迅速的發展，但在質量工藝、質量控制技術和質量標準建立等多方面并不完善。筆者曾對6個廠家茜草配方顆粒樣品進行質量評價，發現其中大葉茜草素的含量差異顯著(差異高達10多倍)[4]，且不同廠家的茜草配方顆粒性狀差異明顯，這表明不同廠家采用的生產工藝不盡相同。為此，本研究通過正交試驗對茜草配方顆粒的提取工藝進行了優選，以期為工業標準化生產提供依據。

盡管有研究用不同濃度的乙醇作為提取溶劑優選茜草的提取工藝[5]，但考慮到配方顆粒劑實際工業生產的經濟因素以及配方顆粒劑是在傳統湯藥基礎上對中藥飲片改革的一種新形式，因此本文仍采用水作為提取溶劑對茜草配方顆粒的提取工藝進行研究。

中藥的成分相對復雜，其提取工藝的評價如采用單一指標進行工藝優選，則代表性較差，不能保證整體質量，故往往采用幾個評判指標共同篩選最佳工藝條件。2010年版《中國藥典》以大葉茜草素和羥基茜草素2種成分作為茜草含量測定的檢測指標，因此本研究采用梯度洗脫的方法對茜草提取液進行分析，同時測定了大葉茜草素和羥基茜草素2種成分的含量。通過對干浸膏得率、大葉茜草素和羥基茜草素提取量等多指標進行綜合評分，可更為有效地評價茜草的提取工藝，使結果更具代表性、合理性和全面性。

由于不同類型的評價指標其結果有時不在同一數量級，直接累加則使數量級大的對結果的貢獻大，而小的貢獻小，因此對多指標正交試驗評價分析時，需解決指標間量綱不一致和相容與否等問題[6]。本研究通過將3個指標轉換成相應的隸屬度，使不同量綱和數量級的指標數據可比化。然后針對各指標重要性的差異給出不同的權重，綜合評分后再進行統計分析。在有效成分明確的前提下，浸膏得率越高則有效成分純度越低，應減少干浸膏得率的權重系數；若指標成分不明確，以浸出物多少來代表有效成分時，干浸膏得率的權重系數應相應增大[7]。由于茜草中除含有大葉茜草素和羥基茜草素等醌類物質外，還含有萜類、己肽類和多糖等多種物質，化學成分較復雜，因此本研究適當地提高了干浸膏得率的權重系數，將其定為0.5，而將大葉茜草素和羥基茜草素2種主要成分的權重系數各定為0.25，這樣經過方差分析優選出的工藝條件更加合理。

研究發現，提取次數和加水量2個因素對水提工藝有顯著性影響，而提取時間影響較小，但若以正交試驗得分最高的組合(A3B3C2)進行實際生產則生產周期長、用水量大，將增加生產成本。在保證提取充分的前提下，從生產實際出發，筆者適當地縮短了提取時間和減少了加水量。通過驗證試驗，本文優選的提取工藝的平均綜合評分達到0.927分，與A3B3C2組合相比，得分減少約7.3%，但提取時間縮短了1.5 小時，從省時節能、降低成本的生產實際出發，確定此條件為最佳提取方案。

參考文獻

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[2] 李云雁，胡傳榮.實驗設計與數據處理[M].2版.北京：化學工業出版社，2008：134-136.

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