妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中ApoE、LPL ser447stop基因多態(tài)性檢測及意義

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006)

妊娠期高血壓疾病(HDP)是妊娠期特有的疾病，為孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的重要死因［1］，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。近期研究表明，HDP患者存在一定程度脂質(zhì)代謝變化，由此推斷該病的發(fā)生、發(fā)展可能與血脂代謝異常有關(guān)［2］。載脂蛋白酶E(ApoE)及脂蛋白脂酶(LPL)是脂代謝的關(guān)鍵因子，若干環(huán)境因素是影響ApoE及LPL突變致病的重要因素，婦女妊娠則是最常見的環(huán)境因素［3］。為探討ApoE基因及LPL基因第9外顯子(ser447stop)多態(tài)性是否與 HDP有關(guān)，本研究采用HDP患者胎盤組織與正常產(chǎn)婦胎盤組織作為研究對象，通過對組織中 ApoE基因及 LPL基因ser447stop多態(tài)性分布情況來探討其與HDP的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取江西省婦幼保健院、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院及贛南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年9月～2010年9月漢族妊娠期高血壓患者36例作為A組，子癇前期94例作B組。產(chǎn)后追蹤12周，均排除原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病。同期選擇正常妊娠婦女130例作為C組。研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會通過。各組年齡、孕前體質(zhì)量、身高、孕產(chǎn)次、孕周情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)中取產(chǎn)婦的胎兒面胎盤組織約5 cm×3 cm×3 cm(避開鈣化、壞死及血管區(qū))，獨(dú)立裝于樣本袋中，保存于－20℃冰箱內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用經(jīng)典的酚—氯仿方法提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.2.2 ApoE基因多態(tài)性檢測 采用等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)(multi-ARMS PCR)技術(shù)。①目的片段的擴(kuò)增:引物設(shè)計根據(jù)Gerard等［4］報道的引物序列。上游引物P1為5'-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3'，P2 為 5'-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3'，P3 為 5'-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3'，P4 為 5'-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3'，以及公共下游引物P5為5'-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3'。按照文獻(xiàn)［5］方法，為了監(jiān)控反應(yīng)體系的有效性，以低密度脂蛋白受體外顯子13為內(nèi)參照系統(tǒng)，引物序列 P6為 5'-AACAACTGACCCCGCTGGCG-3'，P7 為 5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3'。PCR反應(yīng)體系:分為 A、B兩管。其中A管為50 μM/L 的 P1、P3、P6、P7 各0.4 μL，B 管為 50 μM/L的 P2、P4、P6、P7 各 0.4 μL;兩管均加入 50 μM/L的 P5 0.8 μL，dNTP(0.2 mmol/L)0.5 μL，鎂離子(1.5 mmol/L)1.5 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA 模板6 μL，加去離子水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，繼而94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃復(fù)性1 min，共35次循環(huán)后72℃延伸7 min，于4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物放入瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外透射儀下觀察確定ApoE基因型。②ApoE基因型判斷:ApoE的三種異構(gòu)體(ApoE2、ApoE3、ApoE4)的氨基酸順序均已測定，它們的區(qū)別在于第112位和第158位上半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)的互換(即堿基T與C的互換)。ApoE2/2在這兩個位點上均為Cys殘基;ApoE3/3在112位點上是Cys殘基，在158位點上是Arg殘基;ApoE4/4在兩個位點上均為Arg殘基。由此三種異構(gòu)體而形成六種基因表型分別是ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4、ApoE3/2、ApoE4/3 和ApoE4/2。P1和P2分別檢測ApoE 112位的 Cys和Arg，P3和P4分別檢測 ApoE 158位的 Cys和 Arg。A管中P1與P5擴(kuò)增出588 bp片段，P3與P5擴(kuò)增出451 bp片段。B管中P2與P5擴(kuò)增出588 bp片段，P4與P5擴(kuò)增出451 bp片段。

1.2.3 LPL ser447stop基因多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)法(PCRRFLP)。①目的片段的擴(kuò)增:引物根據(jù)引物設(shè)計的一般原則設(shè)計。上游引物為 5'-TATTCACATCCATTTTCTTC-3'，下游引物為 5'-GTCAGCTTTAGCCCAGAATG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為155 bp。擴(kuò)增體系:10 ×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mM)1.5 μL，dNTP(Mix，10 mM)0.5 μL，hot-tag 酶(2.5 U/μL)1 μL，引物(上下游各 50 μM)2 μL，模板 DNA(10 ng/μL)6 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性11 min，繼而94℃變性45 s，57℃退火45 s，71℃復(fù)性1min，共35次循環(huán)后72℃延伸10min，于4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物放入瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外透射儀下觀察拍照。②擴(kuò)增片段的限制性酶切及檢測:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物17μL，加限制性內(nèi)切酶MnlⅠ0.2μL、buffer G 2μL及 ddH2O 5μL;37℃過夜消化后于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，同時電泳槽孔中加入高脂血癥患者的LPL基因突變(ser447stop雜合子)陽性標(biāo)本為對照，置于紫外透射儀下觀察拍照。③酶切產(chǎn)物結(jié)果分析:LPL的ser447stop突變是位于第9外顯子的1 595核苷酸處C和G轉(zhuǎn)換的結(jié)果，這樣絲氨酸447密碼TCA過早的轉(zhuǎn)化為終止密碼子TGA。MnlⅠ內(nèi)切酶能把有ser447stop突變的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切開，即把155 bp片段切成117 bp和38 bp。而無突變的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被MnlⅠ內(nèi)切酶切開，故保持155 bp。按酶切結(jié)果將其分為無突變型(CC)、突變雜合子型(CG)及突變純合子型(GG)。通過將酶切結(jié)果與高脂血癥患者LPL ser447stop雜合子的陽性標(biāo)本進(jìn)行對照來了解其是否存在突變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料用頻數(shù)表示。ApoE等位基因頻數(shù)計算根據(jù)以下公式:ε2=2×E2/2+E2/3+E2/4，ε3=2 × E3/3+E2/3+E3/4，ε4=2 × E4/4+E3/4+E2/4;LPL等位基因頻數(shù)計算根據(jù)以下公式:C=2×CC+CG，G=2×GG+CG;計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ApoE基因型檢測結(jié)果 共檢測到5種ApoE基因表型，分別是 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4 及E4/4(見圖 1、2)。A 組 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4及E4/4基因表型頻率分別為25.00%(9/36)、0、50.00%(18/36)、22.22%(8/36)、0，B 組分別為19.15%(18/94)、0、56.38%(53/94)、24.47%(23/94)、1.06%(1/94)，C 組分別為 14.61%(18/130)、3.08%(4/130)、76.92%(100/130)、5.38%(7/130)、0.77%(1/130)。A、B 組E3/3、E3/4 基因表型與C組比較，P均＜0.01。A組ApoE等位基因ε2、ε3、ε4 頻率分別為 12.50%(9/70)、73.61%(53/70)、11.11%(8/70)，B 組分別為 9.57%(18/190)、78.19(%(147/190)、13.30%(25/190)，C 組分別為 8.46%(22/260)、86.54%(225/260)、5.00%(13/260)。A、B 組 ApoE 等位基因 ε3、ε4 與C 組比較，P 均 ＜0.05。

2.2 LPL ser447stop基因型檢測結(jié)果 所有胎盤組織中發(fā)生LPL ser447stop突變的只有3例，其中B組2例，C組1例，均為突變雜合子型(CG)。各組間比較，P均＞0.05。詳見圖3。

3 討論

圖1 ApoE3/3、E4/4、E4/2 基因型

圖2 ApoE3/2、E4/3基因型

圖3 LPL第9外顯子PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

3.1 脂代謝與正常妊娠的關(guān)系 妊娠期體內(nèi)血脂代謝非常活躍，這對胎兒的生長發(fā)育是有利的［5］。由于妊娠期血脂與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)同時升高，HDL有助于乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的合成，阻止自由膽固醇積累在動脈壁，而且機(jī)體內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)也增強(qiáng)，故妊娠期高脂血癥不能引起心血管疾病的發(fā)生［6］。

3.2 脂代謝與HDP HDP患者在高脂血癥基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)生改變，TG和游離脂肪酸水平異常升高及耗氧量增加，使脂質(zhì)過氧化物(LOP)增多并產(chǎn)生自由基損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，刺激單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁，最后易使LDL-C在血管壁和組織中沉積，形成粥樣斑塊，使小動脈腔狹小，外周阻力增加，血壓升高，導(dǎo)致血管痙攣收縮等一系列病理生理變化。同時，氧化的LDL抑制前列腺素合成酶，使前列環(huán)素(PGI2)減少，激活血栓素合成酶，使血栓素A2生成及血小板凝集，加重血壓升高、血小板凝集而發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、腎及胎盤血管收縮、腦血管收縮造成子癇等。HDP是多因素共同作用的結(jié)果，脂代謝異常可能是其中的一個重要環(huán)節(jié)［7］。

3.3 ApoE的生物學(xué)特性以及其多態(tài)性與HDP的關(guān)系 ApoE是脂蛋白與受體結(jié)合的配體，通過ApoE，膽固醇可在體內(nèi)重新分布。ApoE的多態(tài)性影響血脂的代謝和利用［8］。它有3個主要等位基因(即 ε2、ε3、ε4)，編碼的 3 種異構(gòu)體(即 ApoE2、E3、E4)，形成6 種表型(即 ApoE2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4)。3種異構(gòu)體與脂蛋白受體親和力不同，ApoE2與受體親和力低下，而ApoE4卻很高;ApoE4表型具有升膽固醇的作用，而ApoE2表型則相反［9］。Belo等［10］發(fā)現(xiàn)，ApoE 基因多態(tài)現(xiàn)象并不是先兆子癇發(fā)病的危險因子，僅與妊娠晚期孕婦脂質(zhì)水平有關(guān)。國外也有文獻(xiàn)報道，ApoE等位基因ε2和ε4頻率在非洲及歐洲地區(qū)先兆子癇患者中過度表達(dá)，但同時也有相反的報道［11］。

本研究共檢測到 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4 和E4/4共5種基因表型。其中ApoE3/4基因表型在A、B組的頻率分別是22.22%和24.47%，兩組均較C組(5.38%)高(P 均 ＜0.01)。在 A、B 組中，ε3 等位基因型的頻率分別是73.61%和78.19%，兩組均較C組(86.54%)低(P 均 ＜0.05);而 ε4 等位基因型的頻率分別是11.11%和13.3%，兩組均較C組(5%)高(P均＜0.05)。分析原因可能與ApoE的不同異構(gòu)體與受體的親和力不同有關(guān)。由于親和力不同而導(dǎo)致ApoE濃度的差異，從而影響脂蛋白與受體的結(jié)合，使膽固醇在體內(nèi)的重新分布異常，減緩了外周組織將LDL-C逆轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟的能力，使LDL-C在血管壁和組織中沉積，進(jìn)一步導(dǎo)致妊娠期高血壓的發(fā)生。通過本研究可推斷出ApoE3/4基因表型可能是HDP的危險因素;ε4等位基因可能是HDP的遺傳易患因子，而ε3等位基因可能具有保護(hù)作用。

3.4 LPL基因的生物學(xué)特性及其ser447stop突變與HDP的關(guān)系 LPL水解血液中的甘油三酯，生成的甘油和脂肪酸可供組織氧化分解并提供能量。LPL的缺陷或活性降低均可導(dǎo)致血漿TG及VLDL的升高。近年的研究發(fā)現(xiàn)，LPL基因突變可能與糖尿病、肥胖、冠心病、高血壓、阿爾茨海默病、圍產(chǎn)期疾病等相關(guān)［12］。LPL的基因多態(tài)性對HDP是否有關(guān)聯(lián)也眾說紛蕓，其中LPL ser447stop基因突變對血壓影響的文獻(xiàn)較多見。Salah等［13］研究發(fā)現(xiàn)，LPL ser447stop基因變異的攜帶者發(fā)展為高血壓的風(fēng)險很高。Chen等［14］對臺北地區(qū)HDP的患者及其父母的研究發(fā)現(xiàn)，LPL ser447stop基因突變可能是一種保護(hù)因子。孫瑜等［15］研究LPL的ser447stop變異與HDP的影響發(fā)現(xiàn)，其對HDP無影響。

本研究共檢測到3例突變，其中B組2例，C組1例，均為雜合子。根據(jù)基因多態(tài)性的定義，可以認(rèn)為我們所研究的這一人群可能無LPL ser447stop多態(tài)性。故認(rèn)為LPL ser447stop基因多態(tài)性可能與HDP的發(fā)生無關(guān)。結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)，分析原因推測可能因為人種差異，因此LPL ser447stop基因多態(tài)性對HDP關(guān)聯(lián)的結(jié)果，與國外的報道不同。

綜上所述，HDP與多重因素有關(guān)，而脂代謝異常只是其中一種因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ApoE的不同表型對HDP的發(fā)病率不同，而LPL ser447stop基因多態(tài)性與HDP可能無關(guān)聯(lián)，但因樣本量的局限，仍需進(jìn)行多角度、多層面的試驗方可證實。

［1］樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:92-98.

［2］郭海香，高眉揚(yáng).脂質(zhì)代謝異常在妊娠高血壓疾病的研究進(jìn)展［J］.中國婦幼健康研究，2006，17(3):106-108.

［3］Ray JG，Diamond P，Singh G，etal.Brief overview ofmatemal triglycerides as a risk factor for pre-eclampsia［J］.BJOG，2006，113(4):379-386.

［4］Gerard GD，Ann S，Terho L，et al.Rapid identification of Apolipoprotein E genotypes bymultiplex amplification refractorymutation system PCR and capilliary gel electrophoresis［J］.Clin Chem，1999，45(2):143-145.

［5］孫瑜，白文佩，周世梅，等.脂代謝異常在妊娠高血壓綜合征發(fā)病中的作用［J］.中國圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，4(2):70-72.

［6］張春妮，李麗，劉小傳，等.正常孕婦血清脂蛋白(a)含量調(diào)查及其臨床意義［J］.臨床檢驗雜志，2004，22(2):133-134.

［7］宿仕萍，喬福元.脂代謝異常在子癇前期、子癇發(fā)病中的作用［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2006，22(2):135-136.

［8］田英.研究載脂蛋白E基因多態(tài)性與血清高密度脂蛋白subelasses在妊娠高血壓疾病中的表達(dá)［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22(1):96-98.

［9］Bednarska-Makaruk M，Rodo M.Polymorphisms of apolipoprotein E and angiotensin-converting enzyme genes and carotid atherosclercsis in heavy drinkers［J］.Alcohol Alcohol，2005，40(4):274-282

［10］Belo L，Gaffney D，Rebelo I，et al.Apolipoprotein E and cholesteryl ester transfer proteinpolymorphisms in normal and pre-eclamptic prenancies［J］.Eur JObstet Gynecol Reprod Biol，2004，112(1):9-15.

［11］Chikosi AB，Moodley J，Pegoraro RJ，etal.Apolipoprotein E polymorphism in south african zulu woman with preeclampsia［J］.Hypertens Pregnancy，2000，19(3):309-314.

［12］穆云翔.脂蛋白脂肪酶基因突變研究進(jìn)展［J］.中華老年心腦血管病雜志，2002，10(4):358-362.

［13］Salah A，Khan M，Esmail N，et al.Genetic polymorphism of S447X lipoprotein lipase(LPL)and the susceptibility to hypertension［J］.Crit Care，2009，24(3):4-8.

［14］Chen P，Jou YS，F(xiàn)ann L，et al.Lipoprotein lipase gene is linked and associated with hypertension in Taiwan young-onset hypertension genetic study［J］.Biomed Sci，2005，12(4):651-658.

［15］孫瑜，白文佩，周世梅，等.妊高征患者脂蛋白酯酶基因變異(ser447-Thr)的研究［J］.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2003，4(2):87-89.