槲皮素對腎癌786-0細胞增殖、凋亡的影響及其機制探討

(遼寧醫學院第一附屬醫院，遼寧錦州121001)

近年來研究發現，槲皮素對多種惡性腫瘤具有良好的抗癌功效，而在抗腎癌方面的相關報道較少。2010年3月～2011年9月，我們觀察了槲皮素對腎癌786-0細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 腎癌786-0細胞購自中國科學院上海生化細胞所細胞庫，并經傳代培養至對數生長期;槲皮素，用 DMSO溶解配制成原液，－20℃保存;MTT，Annexin V/PI染色試劑盒，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt及 β-actin;細胞培養箱(NAPCO MODEL5410)，低溫高速離心機(Ependorff，美國)，流式細胞測定儀(Becton-Dickinson，美國)。

1.2 方法

1.2.1 槲皮素對786-0細胞增殖影響的觀察 采用MTT法。取對數生長期的細胞，以2×103/孔接種96孔板，培養24 h;待細胞貼壁后，觀察組分別加入終濃度分別為10、25、50、100μmol/L的槲皮素，對照組加入1‰的DMSO，每組設3個復孔。分別于培養24、48、72 h后，加入5 mg/mL的 MTT 10μL;培養4 h后棄去培養液，加入0.1 mL DMSO;待結晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶聯免疫檢測儀上以570 nm和630 nm雙波長測定每孔的吸光度(A)值。細胞增殖抑制率=(1－觀察組A值/對照組A值)×100%。

1.2.2 槲皮素對786-0細胞凋亡影響的觀察 采用流式細胞術。細胞接種同1.2.1，待細胞貼壁后，觀察組加入終濃度分別為10、25、50μmol/L槲皮素，對照組加入1‰的DMSO，每組設3個復孔。培養48 h后，收集各組細胞，加入適量PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次。加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5μL Annexin V混勻后，加入5μL PI，混勻;室溫、避光反應15 min后，1 h內上流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.2.3 槲皮素對786-0細胞p-Akt及總Akt蛋白表達影響的觀察 細胞接種、分組及處理同1.2.2，培養48 h后，收集各組細胞，采用Wester blot法檢測，按說明書進行。p-Akt(總Akt)表達量=［(實驗組p-Akt(總 Akt)/實驗組 β-actin］/［對照組 p-Akt(總Akt)/對照組 β-actin］。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對786-0細胞增殖的影響 槲皮素對腎癌786-0細胞的生長抑制作用呈現明顯時間及劑量依賴性(P 均 ＜0.05)，見表1。

2.2 槲皮素對786-0細胞凋亡的影響 對照組及觀察組經10、25、50μmol/L的槲皮素處理后，786-0細胞凋亡率分別為 3.16% ±1.78%、13.4% ±3.87%、22.38% ± 2.44%、34.42% ± 5.37%，觀察組細胞凋亡率與對照組相比明顯增加(P均＜0.05)，且隨劑量升高而增加。

表1 槲皮素對腎癌786-0細胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 槲皮素對腎癌786-0細胞增殖抑制率的影響(±s)

槲皮素(μmol/L)細胞增殖抑制率(%)24 h 48 h 72 h 10 88.95 ±3.14 85.41 ±4.78 75.47 ±6.31 25 77.73 ±6.67 64.53 ±5.75 37.56 ±7.75 50 70.72 ±6.58 51.86 ±4.12 24.83 ±8.56 100 66.51 ±8.79 44.98 ±4.67 19.87 ±6.55

2.3 槲皮素對786-0細胞內p-Akt和總Akt表達的影響 10、25、50μmol/L的槲皮素處理48 h后，786-0細胞 p-Akt蛋白相對表達量分別為0.92±0.05、0.54 ±0.06、0.33 ±0.04，總 Akt蛋白相對表達量分別為1.03 ±0.08、0.93 ±0.12、0.54 ±0.06。不同濃度槲皮素處理后786-0細胞內p-Akt表達水平比較，P 均 ＜0.05。

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于植物、食物及中草藥之中。近年來研究表明，槲皮素具有調控多種腫瘤細胞增殖和凋亡的作用。王旭等［1］將體外培養的卵巢癌HO-8910細胞用不同濃度的的槲皮素處理，發現槲皮素能抑制HO-8910細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性(P均＜0.05)。趙旭林等［2］研究發現，槲皮素可顯著抑制肝癌HepG2細胞生長，并能誘導腫瘤細胞發生凋亡，提示誘導凋亡為槲皮素抑癌的機制之一。馬朋等［3］研究發現，槲皮素對人宮頸癌Hela細胞增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。經槲皮素作用48 h后，AO/EB雙重染色可見細胞呈凋亡樣改變;槲皮素作用Hela細胞24、48 h后，與對照組相比線粒體膜電位下降，此結果提示槲皮素能體外抑制人宮頸癌Hela細胞生長，誘導細胞凋亡。另外研究［4，5］發現，槲皮素能顯著抑制人鼻咽癌 CNE2 細胞、乳腺癌MCF-7細胞增殖，促進其凋亡。槲皮素抗腫瘤作用具有選擇性，對正常細胞的毒性微弱［6］，因此是一種較為理想的抗腫瘤藥物，其制劑已進入Ⅰ期臨床研究階段［7］。本研究結果表明，槲皮素能夠有效地抑制腎癌786-0細胞增殖，其抗腫瘤作用主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而實現的。

關于槲皮素誘導腫瘤細胞凋亡的機制，目前尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt通路是細胞內調控增殖與凋亡的重要傳導通路。其中Akt位于PI3K的下游，活化后可磷酸化其下游靶蛋白，進而促進一系列細胞生長相關基因的轉錄，引起細胞快速增殖［8］。龐瑞萍等［9］研究發現，吲哚美辛可能通過Akt信號通路誘導胃癌細胞MGC-803的凋亡。張敏等［17］應用脫氧核酶抑制Akt表達，發現Akt脫氧核酶對MCF-7乳腺癌細胞在體外的生長具有抑制作用。Hara等［11］研究發現，與正常腎組織相比，腎癌組織中p-Akt表達顯著升高，提示應用Akt抑制劑可誘導腎癌細胞發生凋亡。本研究發現，786-0細胞在靜息狀態下即存在PI3K/Akt通路的活化，以槲皮素處理后PI3K/Akt通路活性明顯下降，提示槲皮素可能通過抑制PI3K/Akt通路活性發揮對腎癌的抗腫瘤作用。下一步作者將使用大鼠進行體內實驗，研究槲皮素對于體內實體腫瘤的抑癌作用。

［1］王旭，張爽.槲皮素對卵巢癌細胞HO-8910增殖的抑制作用及機制［J］.山東醫藥，2010，50(6):14-16.

［2］趙旭林，徐國昌，賀利民，等.槲皮素誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的作用［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18(3):310-311.

［3］馬朋，宋曉冬，閆苗苗，等.槲皮素誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的作用［J］.解剖學雜志，2011，34(4):462-465.

［4］楊娜，朱開梅，顧生玖.槐米中槲皮素對人鼻咽癌CNE2細胞增殖與凋亡作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2011，22(9):2215-2217.

［5］高薇，劉洪，孫靜.槲皮素誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的實驗研究［J］.齊齊哈爾醫學院學報，2011，32(6):849-851.

［6］Cheng S，Gao N，Zhang Z，et al.Quercetin induces tumor-selective apoptosis through downregulation of Mcl-1 and activation of Bax［J］.Clin Cancer Res，2010，16(23):5679-5691.

［7］Mulholland PJ，Ferry DR，Anderson D，et al.Pre-clinical and clinical study of QC12，awater-soluble，pro-drug of quercetin［J］.Ann Oncol，2001，12(2):245-248.

［8］Carnero A.The PKB/AKT pathway in cancer［J］.Curr Pharm-Des，2010，16(1):34-44.

［9］龐瑞萍，胡品津，曾志榮，等.吲哚美辛通過Akt/GSK3β/NAG-1信號通路誘導胃癌細胞的凋亡［J］.中國病理生理雜志，2011，27(8):1513-1518.

［10］張敏，趙航，付強，等.脫氧核酶抑制Akt1基因對MCF-7乳腺癌細胞生長的影響［J］.醫學分子生物學雜志，2011，8(4):323-326.

［11］Hara S，Oya M，Mizuno R，etal.Aktactivation in renal cell carcinoma:contribution of a decreased PTEN expression and the induction of apoptosis by an Akt inhibitor［J］.Ann Onco，2005，16(6):928-933.