ADC處理前后子宮內膜癌細胞中ER亞型甲基化狀態(tài)及其蛋白表達變化

(遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州121001)

研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，雌激素—雌激素受體(ER)有兩種亞型ERα(-A、-B、-C)、ERβ。近年來，關于腫瘤組織中抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化成為研究的一個新熱點。抑癌基因的沉默、DNA的錯配修飾都與其相關基因甲基化改變密切相關［1～4］。2011年5～9月，我們觀察了DNA甲基化抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷(ADC)處理前后子宮內膜癌細胞中ERα各亞型的甲基化狀態(tài)及其蛋白表達的變化，探討ERα各亞型CPG島甲基化狀態(tài)與子宮內膜癌的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內膜癌細胞系Ishikawa(ER高表達)由北京大學人民醫(yī)院惠贈，HEC-1B細胞系(ER低表達)購自中國生命科學院上海細胞庫，均經(jīng)傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。離心柱型DNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，Zymo Research EZ DNA Methylation Kit購自 Promage公司，ADC購自Sigma公司，ER多單隆抗體購自Santa Cruz公司。參考文獻設計［5］各引物序列，由Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ADC對子宮內膜癌細胞最佳抑制濃度的確定 采用MTT法。取對數(shù)生長期的Ishikawa和HEC-1B消化傳代后，以3×103/孔接種96孔板，待細胞貼壁后，觀察組分別加入終質量濃度為1、2、4、8μg/mL的ADC培養(yǎng)72 h，對照組不加ADC;再加入0.5%MTT 20μL培養(yǎng)4 h，棄上清;每孔加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min，用酶標儀測定每孔490 nm波長處光密度(OD)值。計算細胞增殖抑制率，確定ADC最佳抑制濃度。細胞增殖抑制率=(1－觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 ADC處理前后ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測 采用甲基化特異性PCR(MSP)法。取ADC最佳抑制濃度處理前后的Ishikawa和Hec-1B，按DNA提取試劑盒(離心柱法)說明抽提細胞DNA;采用 Zymo Research EZDNA Methylation Kit對提取的DNA進行甲基化處理(純化和修飾)，以修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，從而檢測ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

1.2.3 ADC處理前后 ERα蛋白表達檢測 取ADC最佳抑制濃度處理前后的Ishikawa和Hec-1B，用細胞裂解液提取細胞內總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。采用Western blot法檢測ERα蛋白，以β-actin蛋白作為內參，按說明書操作，以ERα與內參β-actin的吸光度值的比值作為ERα蛋白的相對表達量。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較采用多樣本單因素方差分析及t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度ADC處理后Ishikawa和Hec-1B細胞的增殖抑制率 兩種細胞增殖抑制率均增加，并在1～4μg/mL呈劑量依賴性(P均＜0.05);4μg/mL時ADC抑制效應最大，故以4μg/mL為ADC的最佳抑制濃度。見表1。

表1 不同濃度ADC處理后子宮內膜癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

表1 不同濃度ADC處理后子宮內膜癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

ADC(μg/mL)細胞增殖抑制率Ishikawa Hec-1B 1 20.14 ±0.12 22.91 ±0.12 2 42.66 ±0.94 51.13 ±0.10 4 66.72 ±0.58 69.92 ±0.67 8 70.33 ±0.53 73.25 ±0.58

2.2 ADC處理前后子宮內膜癌細胞ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 對Ishikawa和Hec-1B細胞采用4μg/mL ADC處理，MSP結果顯示，ADC處理前ERα和ERβ各亞型中，只有ERα-C出現(xiàn)甲基化條帶，其他各亞型出現(xiàn)非甲基化條帶;ADC處理后ERα-C甲基化條帶消失，出現(xiàn)非甲基化條帶，其他各亞型非甲基化條帶不變。

2.3 ADC處理前后子宮內膜癌細胞ERα蛋白表達情況 ADC處理前后子宮內膜細胞ERα蛋白相對表達量比較，見表2。

表2 ADC處理前后子宮內膜癌細胞ERα蛋白相對表達量比較(±s)

表2 ADC處理前后子宮內膜癌細胞ERα蛋白相對表達量比較(±s)

注:與同細胞系處理前比較，*P＜0.01

子宮內膜癌細胞ERα蛋白處理前 處理后Ishikawa 83.19 ±4.12 161.33 ±9.71*Hec-1B 62.24 ±7.93 129.66 ±7.09*

3 討論

ER屬于類固醇受體超家族，與雌激素結合后以二聚體的形式與DNA激素反應元件結合。通過募集共激活子和普通轉錄因子與激素反應基因的啟動子結合而啟動轉錄，激活靶細胞內調節(jié)基因產(chǎn)生生物學效應［6］。維持子宮內膜正常功能依賴于雌激素的作用，ER作為雌激素所控制的信號轉導途徑中的關鍵環(huán)節(jié)，其正常表達對子宮內膜細胞分化和功能至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內膜相比，子宮內膜癌組織中ER陽性率明顯降低。Ali等［7］在人子宮內膜癌Ishikawa細胞中發(fā)現(xiàn)，高水平的ERα通過抑制血管生成旁路而對子宮內膜癌有抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ER基因的啟動子區(qū)和外顯子1區(qū)富含CpG島，甲基化可能是ER表達降低的主要原因。Shiozawa等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ER蛋白的表達與其基因的甲基化呈反向相關，93%ER陽性的子宮內膜癌其甲基化均為陰性，而83%甲基化陽性的腫瘤其ER表達則為陰性。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在ERα-A、ERα-B、ERα-C和ERβ中，只有 ERα-C基因存在甲基化。這與Sasaki等［8］的研究結果相一致。

DNA異常甲基化能使基因表達沉默、基因組DNA不穩(wěn)定性增加，但DNA甲基化引起的基因型的變化又是可逆的、早期的。已有研究［9］表明，子宮內膜組織中ERα表達較ERβ多，表達范圍更廣泛，因而有學者認為在子宮內膜癌的病因中，雌激素主要通過ERα發(fā)揮作用。目前，公認內分泌治療對晚期或復發(fā)子宮內膜癌患者有效，可以延長患者生存時間。內分泌治療的關鍵是恢復雌孕激素受體的表達，如果能在ER陰性細胞中恢復其表達，內分泌治療也會再次有效。本研究對子宮內膜癌細胞系Ishikawa和Hec-1B給予去甲基化處理，加入去甲基化藥物ADC后，ERα-C甲基化條帶消失，ERα蛋白表達明顯增強。證明ERα-C啟動子的甲基化可以導致ER蛋白表達降低，子宮內膜癌中ER的低表達或失表達與 ERα-C啟動子的甲基化密切相關。DNA甲基化是一種可逆過程，應用DNA甲基化抑制劑可以使一些重要基因發(fā)生去甲基化，恢復正常功能。目前，ADC已應用于臨床實驗作為常規(guī)化療方案的補充，用于治療兒童白血病等腫瘤，這將為我們臨床治療子宮內膜癌提供新的方向，而今后更多的DNA甲基化抑制劑出現(xiàn)，將為臨床藥物治療子宮內膜癌提供新的方法。

［1］Jones PA，Baylin SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer［J］.Nat Rev Genet，2002，3(6):415-428.

［2］Ballestar E，Esteller M.The impact of chromatin in human cancer:linking DNA methylation to gene silencing［J］.Carcinogenesis，2002，23(7):1103-1109.

［3］El-Osta A.The rise and fall of genomic methylation in cancer［J］.Leukemia，2004，18(2):233-237.

［4］Feinberg AP，CuiH.DNA methylation and genomic imprinting:insights from cancer into epigenetic mechanisms［J］.Semin Cancer Biol，2002，12(4):389-398.

［5］Shiozawa T，Itoh K，Horiuchi A，etal.Down-regulation of estrogen receptor by themethylation of the estrogen receptor gene in endometrial carcinoma［J］.Anticancer Res，2002，22(1A):139-143.

［6］Schiff R，Massarweh S，Shou J，et al.Breast cancer endocrine resistance:how growth factor signaling and estrogen receptor coregulatiorsmodulate response［J］.Clin Cancer Res，2003，9(1pt2):447-454.

［7］AliSH，Odonnejj AL，Balu D，etal.Estrogen receptor-alpha in the inhibition of cancer growth and angiogenesis［J］.Cancer Res，2000，60(74):7094-7098.

［8］SasakiM，Kotcherguina L，Dharia A，et al.Cytosine-phosphoguanine Methylation of estrogen receptors in endometrial cancer［J］.Cancer Res，2001，61(8):3262-3266.

［9］吳成，廖秦平.雌激素受體亞型mRNA在子宮內膜癌組織中的表達［J］.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2003，4(12):198-120.