膀胱癌組織中MACC1、c-Met表達變化及意義

龍俊任，董自強，熊 飛，胡敬祖，侯 毅，韓 鈺

(1三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌443003;2三峽大學分子生物學研究所)

結腸癌轉移相關基因1(MACC1)是肝細胞生長因子信號通路(HGF/c-Met)的一個關鍵調節因子，在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及腫瘤組織的血管形成等過程中發揮著重要作用［1］。2009年10月～2011年5月，我們采用RT-PCR法和免疫組化法檢測膀胱癌組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 膀胱癌患者47例，男29例、女18例，年齡30 ～82 歲;臨床分期 T1～2期 15 例，T3～4期32例;病理分化為低分化28例，高分化19例。患者術前均未行放療和化療，術中留取膀胱癌組織及其癌旁組織標本各47例。將術中切除的新鮮組織標本分成2份:1份立即放入液氮中保存;另1份用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 MACC1、c-MetmRNA 檢測方法 采用 RTPCR法。用RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，并定量RNA純度及濃度，按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，進行聚合酶鏈反應。引物由上海生物工程有限公司合成。循環條件:94℃預變性5min，94℃變性30 s，55 ℃(56 ℃，β-actin)退火 30 s，72 ℃延伸30 s，30個(28個，β-actin)循環后于72℃延伸5 min;經瓊脂糖凝膠電泳，Gel Logic-200凝膠成像系統掃描分析測定電泳條帶相對吸光度值;以β-actin為內參照，計算 MACC1、c-MetmRNA的相對表達量。

1.2.2 MACC1和c-Met蛋白檢測方法 采用免疫組化SABC法。用石蠟包埋膀胱癌及癌旁組織，4 μm層厚連續切片，脫蠟、修復，常規SABC免疫組化染色。光鏡下觀察，棕黃色著色為陽性細胞。無著色為0分，著淡黃色為1分，著黃色為2分，著黃棕或棕褐色為3分;陽性細胞所占百分比≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。兩項得分相乘≤1分為陰性，＞1分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。組間數據比較用t檢驗、χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌及癌旁組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達 見表1。

表1 膀胱癌及癌旁組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達情況

2.2 MACC1和c-Met蛋白表達與膀胱癌臨床病理參數的關系 MACC1、c-Met蛋白表達與膀胱癌的臨床分期、分化程度及淋巴結轉移有關(P均＜0.05)，見表2。

表2 MACC1、c-Met表達與膀胱癌臨床病理參數的關系(例)

3 討論

MACC1基因首先在人結腸癌組織中被鑒定出來，位于人類的7號染色體上(7p21.1)，其生物學功能廣泛，在調節細胞增殖、存活和分化等方面起著重要作用，是調節HGF/c-Met通路中Met基因的關鍵因子［1］。文獻報道，MACC1在許多的正常人體組織中均呈低水平表達，但在多種腫瘤組織表達都明顯增高，認為可以把MACC1蛋白作為一種新的腫瘤診斷標志物［2～6］。

本研究顯示，MACC1和c-MetmRNA及其蛋白在膀胱癌組織中的表達量均顯著高于癌旁組織(P均＜0.05)，且與膀胱癌的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關(P均＜0.05)，說明兩者在膀胱癌的發生、發展中起重要作用。有學者在腦膠質瘤細胞及腎癌細胞中證實，siRNA-MACC1能夠抑制細胞中MACC1蛋白的表達，而c-Met蛋白的表達也明顯下調，腫瘤細胞的增殖能力明顯降低，推測異常表達的MACC1可激活下游的HGF/c-Met信號通路，增加c-Met蛋白的表達，兩者協同增加腫瘤細胞的增殖能力，進而導致腫瘤轉移和復發［3，7～9］。體內外實驗證實:①MACC1與HGF/c-Met之間存在一個正反饋環路:HGF促進MACC1由胞質轉移至胞核內，與c-Met的啟動子結合，上調c-Met的轉錄，c-Met的表達可以增強HGF的作用;②HGF/c-Met還可以激活下游靶基因 MAPK，而 MAPK信號通路可激活MACC1啟動子，明顯提高MACC1的表達，促進腫瘤細胞的增殖分裂［8］。利用siRNA-MACC1不僅可下調MACC1蛋白表達，降低卵巢癌細胞株OVCAR-3的惡性潛能，并下調其下游 Met、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Cyclin D1、MMP2 蛋白表達，但 Capase-3 的表達卻是升高的［10］。MACC1和c-Met兩者結合的機制可能是MACC1基因可結合在原癌基因Met基因啟動子近端約60 bp的啟動子片段上，其中包括一個特異性的Sp1結合位點，而這個結合位點是MACC1誘導的Met基因表達和HGF/c-Met信號通路激活所必需的［1，6，11］。

目前，c-Met已被開發作為膀胱腫瘤基因治療及藥物治療的靶分子［12］。隨著對MACC1和c-Met相關性研究的深入，可能為膀胱癌的臨床治療開辟一條新的路徑。

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