用HPLC柱后衍生法分析煙草中氨基甲酸酯類農藥殘留

邵金良，汪祿祥，劉宏程，蘭珊珊，梅文泉，鄒艷虹，楊 芳

（云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，昆明 650223）

氨基甲酸酯類農藥是以甲酸酯為前體化合物發展而來的農藥，具有分解快、殘留期短、低毒、高效、選擇性強等特點，是繼有機磷之后在煙草種植過程中使用較為廣泛的殺蟲劑和除草劑[1]。農藥在保護煙草產品質量的同時，其在煙草中的殘留也會對人體造成不同程度的傷害[2]。大多數氨基甲酸酯類農藥施用后在很短的時間內就可被降解，降解產物的活性通常與母體化合物相當或更強，毒性甚至更大。例如涕滅威降解后生成的涕滅威亞砜、涕滅威砜的毒性比涕滅威強。因此，在檢測氨基甲酸酯類農藥殘留時，必須同時檢測代謝產物[3]。

目前，關于氨基甲酸酯類農藥殘留量的分析國內外均有報道，檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[4]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜法（LC）[6]、高效液相色譜-質譜法（LC-MS）[7]等。這些方法各有優缺點，由于氨基甲酸酯類化合物極性強，熱穩定性較差，使用GC或GC-MS檢測時常采用特殊的技術或手段以達到準確測定的目的，方法復雜[8]。而用HPLC進行分析，氨基甲酸酯類化合物的紫外吸收較弱，直接檢測靈敏度較低[1]。用高效液相色譜柱后衍生系統、熒光檢測器檢測煙草中氨基甲酸酯類農藥時，背景中幾乎不含有帶-CONH-基團的物質干擾，很難衍生成具有熒光的物質，因此，具有雜質干擾小，檢測穩定，靈敏度高、重現性好等優點[9]。本試驗并優化了煙草中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種農藥的樣品前處理方法和高效液相色譜分離檢測條件，對煙草中8種氨基甲酸酯類農藥殘留高效液相色譜（帶熒光檢測器和柱后衍生系統）多殘留檢測方法進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀-熒光檢測器（PerkinElmer 200A）、色譜柱 Waters Symmetry Shield?（C18，5 μm，4.6×250 mm）、回旋式震蕩器（HY-5）、旋轉蒸發儀（RE-52AA）、SPE凈化柱（Florisil-SPE 1 g/6mL；LC-NH2–SPE 500 mg/3mL；C181 g/6mL）、氮吹儀（Organomation Associates）、超純水機（Arium 611）。

1.1.2 試劑 乙腈（AR）、二氯甲烷（AR）、乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、NaOH溶液、OPA稀釋溶液、鄰苯二甲醛、巰基乙醇、涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種農藥標準品（1000.0 mg/L農業部環境保護科研監測所生產）。

1.2 樣品的處理與分析

1.2.1 樣品處理 稱取5.0 g煙葉樣品于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙腈:水（1:1，V/V）按文獻[10]步驟進行提取。用 2 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）溶解樣品，待凈化。凈化用NH2-SPE柱。5 mL二氯甲烷:甲醇（1:99，V/V）預淋洗，棄去淋出液，將上述2 mL二氯甲烷:甲醇溶液轉入柱中，用6 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）淋洗SPE柱，收集淋出液，40 ℃氮吹濃縮至近干，用2 mL甲醇定容，經0.22 μm有機相濾膜過濾，待測定。

1.2.2 色譜條件 流動相：乙腈/水(0～8 min，25:75，V/V；8～25 min，45:55，V/V；25～28 min，25:75，V/V) ；流速1.0 mL/min；測定波長Ex=339 nm，Em=445 nm；柱溫30.0 ℃；進樣量：10.0 μL；柱后衍生條件：0.05 mol/L NaOH 溶液，流速0.30 mL/min；OPA試劑，流速0.30 mL/min；衍生溫度80 ℃。

1.2.3 保留時間 涕滅威亞砜 4.28～4.34 min，涕滅威砜5.55～5.70 min，滅多威6.42～6.55 min，三羥基克百威 9.01～9.21 min，涕滅威 15.24～15.45 min，克百威 18.50～18.81 min，甲萘威 20.03～20.50 min，異丙威22.85～23.34 min。

2 結果與討論

2.1 線性關系和檢出限

取一定量的氨基甲酸酯混標準母液，稀釋成濃度分別為0.02，0.2，1.0，5.0，10.0 mg/kg的氨基甲酸酯標準曲線工作液，按上述方法提取，凈化和測定，繪制標準曲線[11]。8種氨基甲酸酯農藥的線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限見表 1，相關圖譜見圖1～3。

2.2 添加回收率與相對標準偏差

以干煙葉為對照樣品，分別添加3個不同濃度的8種氨基甲酸酯農藥標準品溶液，每個樣品重復5次，按上述方法提取、凈化和檢測。表2可見，樣品加標濃度為 0.05 mg/kg時，平均回收率為80.8%～110.6%，相對標準偏差為 3.2%～10.8%；0.1 mg/kg時，平均回收率為84.4%～109.7%，相對標準偏差為3.8%～11.8%；0.5 mg/kg時，平均回收率為 81.6%～112.9%，相對標準偏差為 3.7%～8.5%。

圖1 煙葉對照色譜圖Fig.1 Chromatogram of tobacco blank

圖2 煙葉加標色譜圖（0.1 mg/kg）Fig.2 Chromatograms of tobacco sample spiked at 0.1 mg/kg of each pesticide

圖3 8種氨基甲酸酯色譜圖（0.1 mg/L）Fig.3 Chromatogram of 8 carbamate pesticides

表1 8種氨基甲酸酯類農藥殘留的回歸方程、相關系數Table1 Linearity and limits of detection of the 8 carbamate pesticides

2.3 最佳操作條件的選擇

2.3.1 提取溶劑的選擇 在氨基甲酸酯類農藥殘留分析中常用的提取溶劑有乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等[12]。分別選擇甲醇:水（1:1，V/V）、乙腈:水（1:1，V/V）、丙酮:水（1:1，V/V）、乙酸乙酯:水（1:1，V/V）作為提取溶劑，相同試驗條件下，加標濃度為0.1 mg/kg。試驗結果表明（圖4），使用丙酮:水（1:1，V/V）的平均回收率為 61.8%，乙酸乙酯:水（1:1，V/V）為67.5%，其回收率明顯低于甲醇:水（1:1，V/V）的81.3%和乙腈:水（1:1，V/V）的 94.1%。而用乙腈:水（1:1，V/V）提取的樣品基質干擾較小，考慮到綜合提取效率、選擇性、溶劑化作用和滲透能力等因素，本方法采用乙腈:水（1:1，V/V）作為提取溶劑。以1:1比例的乙腈/水提取后再以 10%氯化鈉溶液和二氯甲烷萃取，能更好的避免將色素、焦油及水溶性雜質提取出來，使提取液更潔凈，無較大干擾峰[13]。

2.3.2 固相萃取柱的選擇 煙草是含有大量脂肪、色素、多糖等大分子組分的復雜基質[13]。對于極性較大的氨基甲酸酯類農藥殘留的分析，采用液-液分配法凈化后，回收率往往很低，有一定的局限性，目前多采用固相萃取技術進行凈化，具有操作步驟少，溶劑用量少等優點。本文考察氟羅里硅柱、C18柱、氨基固相萃取柱的凈化效果。在煙葉中添加已知量的氨基甲酸酯農藥標準品，8種氨基甲酸酯農藥經氟羅里硅土柱凈化，回收率只有65.0%，而經C18和氨基固相萃取柱凈化，回收率有95.0%。實際樣品測定時，C18固相萃取柱凈化，存在部分干擾；氨基固相萃取柱能有效地吸附有機酸和糖分，回收率高且沒有干擾。

表2 煙草氨基甲酸酯類農藥加標回收率和重復性試驗結果（n=5）Table2 Recoveries and coefficient variations of 8 carbamate pesticides

2.3.3 洗脫液配比和洗脫體積的選擇 氨基固相萃取柱經活化后，取 8種農藥的混合標樣（0.25 mg/L）1 mL上樣，平行3份，分別用甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V），甲醇:二氯甲烷（3:97，V/V），甲醇：二氯甲烷（5:95，V/V）及甲醇:二氯甲烷（7:93，V/V）等4種溶液洗脫。甲醇體積分數為1%～7%時，8種氨基甲酸酯的回收率基本穩定，隨著甲醇用量增加雜質峰也明顯增多，因此選擇甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）作為洗脫溶液。在優選洗脫劑配比的基礎上，進一步篩選洗脫劑用量對回收率的影響，結果表明，前4 mL洗脫液對回收率的影響最大，當洗脫液體積達到8 mL時，繼續增大洗脫液用量，對8種氨基甲酸酯的回收率沒有影響。

2.3.4 流動相的選擇 為了獲得最佳分離效果，分別考察了乙腈、水及甲醇、水溶液作流動相時的分離情況；分別考察等度和梯度洗脫條件對分離效果的影響。結果發現，甲醇+水，乙腈+水可以實現氨基甲酸酯類農藥的有效分離，當乙腈+水體系作為流動相時，待測物氨基甲酸酯類農藥的響應信號較強，分離效果更好。而甲醇+水體系流動相的極性雜質較多，個別峰形不理想，干擾較大，響應信號較低，故選擇乙腈+水體系作為流動相。

淋洗條件試驗結果表明，乙腈相配比越大，出峰越快，峰形越好，但分離度較差；水相配比加大，分離度提高，但峰型寬，分析時間長。當乙腈體積分數從25%線性遞增至45%并保持不變時，隨著洗脫能力增強，涕滅威、克百威、甲萘威和異丙威依次流出，峰面積信號也最強，且前者的峰形更對稱。為了使8種氨基甲酸酯類農藥既能在盡量短的時間內完全分離，又能得到峰型較好的色譜峰，經實驗確定最佳梯度洗脫條件見表 3。采用該色譜條件可使8種氨基甲酸酯類農藥完全分離并能大大縮短分析時間。

2.4 實際樣品分析

應用建立的高效液相色譜-柱后衍生熒光分析方法，測定了12個煙草樣品中8種氨基甲酸酯類農藥的殘留量，均未檢出氨基甲酸酯類農藥殘留。

表3 8種氨基甲酸酯類農藥梯度洗脫條件Table3 Gradient elution conditions of 8 carbamate pesticides

3 結 論

本研究建立了一種快速測定煙草中氨基甲酸酯類農藥殘留的高效液相色譜-柱后衍生熒光定量方法，在25 min內可同時完成煙草中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種氨基甲酸酯農藥的分析測定。本方法具有多種農殘同時提取、凈化，準確度高、重現性好等優點，可用于煙草中多種氨基甲酸酯類農藥殘留的分析。

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