毛木耳原生質體制備與再生條件的研究*

孫 露，姚方杰,2**，方 明

（1吉林農業大學園藝學院，長春 130118；2食藥用菌教育部工程研究中心，長春 130118）

原生質體技術是為食用菌細胞生物工程育種提供了新技術，在食用菌育種中具有明顯的開拓性[1、2]。在木耳屬中大量栽培的有木耳和毛木耳2個種，但是有關原生質體的研究卻多集中于栽培量最大的木耳上，而對產量僅次于木耳的毛木耳的研究卻較少[3－6]。本試驗對影響毛木耳原生質體制備與再生的若干條件進行研究，旨在建立起最佳的毛木耳原生質體制備、再生體系，為進一步開展毛木耳等木耳屬食用菌的遺傳育種研究提供技術支持。

1 供試菌株

供試菌株由吉林農業大學園藝學院提供 （由云南農科院采集于云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣內山區）。

2 試驗方法

2.1 原生質體制備條件的優化

采用SMY液體培養基培養菌絲。

分別設置4個培養時間、4個酶解溫度、5個酶解時間、5個融壁酶濃度、4種滲透壓穩定劑及其4濃度進行原生質體制備條件的優化研究。

菌絲培養及原生質體制備參照木耳[4]。

2.2 原生質體再生條件 （培養基）的優化

設計3個配方篩選最佳再生培養基。即在基本配方（馬鈴薯 200g、 葡萄糖 20 g、 蛋白胨 2 g、 MgSO40.5 g、K2HPO41 g、 KH2PO40.46 g、 VB110 mg、 瓊脂 15 g/8 g、 水1 000 mL）內加入 0.5M MgSO4的為 RM1 （MgSO4）， 0.5M甘露醇的為RM2（甘露），0.5M蔗糖RM3（蔗糖）。

3 結果與分析

3.1 出發菌齡

菌株的生理狀態是影響其原生質體化的內在因素，其中菌齡對原生質體制備的影響尤為明顯。本試驗選擇培養4 d~7 d的幼齡菌絲體進行試驗，制得原生質體數量由多到少順序為5 d＞6 d＞4 d＞7 d，如圖1。毛木耳菌株培養5 d時原生質體產量最大達到1.0×107個·ml-1。

圖1 不同菌齡制得原生質體數量Figure 1 Protoplast number of different cell ages

3.2 融壁酶濃度

根據不同的食用菌種類及細胞壁成分應選擇相應的融壁酶。本試驗選用廣東微生物所產的融壁酶，制備效果較好。如圖2，原生質體數量由多到少順序為1.5%＞2%＞1%＞2.5%＞3%。融壁酶濃度為1.5%時原生質體產量最大達到1.11×107個·mL-1。隨著酶濃度的增大，原生質體產量有先上升后下降的趨勢。因此，毛木耳原生質體制備的最佳的酶濃度為1.5%。

圖2 不同融壁酶濃度制得原生質體數量Figure 2 Protoplast number of different enzyme concentration

3.3 酶解溫度及酶解時間

酶解溫度和酶解時間是影響原生質體產量的兩個重要因素。本試驗選擇25℃、30℃、35℃、40℃四個溫度進行試驗，原生質體產量如圖3。隨著酶解溫度的升高，原生質體產量呈現先上升后下降的趨勢，在30℃時原生質體產量達到最大值 1.04×107個·mL-1。

不同酶解的時間，會有不同的位置發生酶解，因此所得到的原生質體產量及生理活性也不一樣,如圖4。隨著酶解時間的延長，原生質體產量也呈現先上升后下降的趨勢，酶解3 h時原生質體產量達到最大值9.6×106個·mL-1。酶解時間再延長反而會導致原生質體產量的下降。因此，毛木耳原生質體制備的最佳酶解溫度為30℃，酶解時間為3 h。

3.4 滲透壓穩定劑種類及濃度

圖3 不同酶解溫度制得原生質體數量Figure 3 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis tem perature

圖4 不同酶解時間制得原生質體數量Figure 4 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis time

圖5 不同滲透壓穩定劑制得原生質體數量Figure 5 Protoplast number of different osmotic stabilizer

圖6 不同滲透壓穩定劑濃度制得原生質體數量Figure 6 Protoplast number of different osmotic stabilizer concen tration

由圖5、圖6看出，利用不同滲透壓穩定劑制得的原生質體數量由多到少為甘露醇＞MgSO4＞蔗糖＞KCl。甘露醇作為滲透壓穩定劑，濃度為0.5 M時原生質體產量高達1.02×107個·mL－1。 圖 7 為供試菌株在最佳原生質體制備條件下得到的原生質體。

圖7 毛木耳原生質體 (40倍)Figure 7 Protoplasts of Auricularia polytricha (40 times)

3.5 再生培養基類型

在三種再生培養基中，RM1（MgSO4）的再生菌落極少，再生率幾乎為0；RM2（甘露醇）的再生菌落較多，再生率為0.196%；RM3（蔗糖）的再生菌落最多 （如圖8），再生率為1.144%。因此，RM3為毛木耳原生質體的最佳再生培養基。

4 討論與結論

本試驗結果表明，毛木耳原生質體制備的最佳條件：菌齡5d；融壁酶濃度為1.5%，酶解溫度30℃，酶解時間3h；滲透壓穩定劑選擇甘露醇，濃度為0.5 M。在最佳酶解條件下， 原生質體數量可達到 1.1×107個·mL－1。

最適再生培養基配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋 白 胨 2 g， MgSO40.5 g， K2HPO41 g， KH2PO40.46 g，VB110 mg， 瓊脂 15g/8 g， 0.5M 蔗糖,水 1 000 mL。

圖8 原生質體再生菌落Figure 8 Protoplast regeneration

但是，與其它食用菌相比，毛木耳原生質體的再生率較低，在最佳制備及再生條件下僅為1.144%。這可能是由于毛木耳菌絲生長速度較慢造成的。有研究表明，食用菌原生質體再生率與其生長速度成正相關，生長速度慢的再生率也低，受其自身的遺傳特性的影響

[1]劉祖同，羅信昌.食用蕈菌生物技術及應用[M].北京：清華大學出版社，2002.

[2]李守勉，李明，刑蕾，等.食用菌原生質體技術應用的研究 [J].安徽農業科 2007， 35(25):7770－7771.

[3]姚方杰，張友民，陳影.我國黑木耳產業發展形勢 [J].北方園藝,2010， 18:209－211.

[4]羅信昌.光木耳和毛木耳原生質體的形成和再生 [J].華中農業大學學報， 1987， 6(2):189－191.

[5]韓增華，張丕奇，戴肖東，等.黑木耳原生質體制備、再生及單核體熒光鑒定[J].食用菌學報， 2008， 15(3):13－17.

[6]李楠，許修宏.黑木耳原生質體制備及再生的研究 [J].東北農業大學學報， 2009， 40(7):34－37.