HSP70-HBsAg基因修飾DC瘤苗抗肝癌作用的實驗研究

幸思忠 薛冀蘇 李鶴平 賴伏虎 黃呈輝 曾志榮 楊建勇 龍健婷

肝癌為我國常見惡性腫瘤之一，我國每年約有11萬人死于肝癌，且發病率有上升趨勢。肝癌的免疫治療是醫學領域研究的熱門課題。在我國，肝癌的發生與HBV感染密切相關，相關研究已經發現肝癌患者血清乙肝表面抗原（HBsAg）檢出率高達90%以上，提示HBsAg是肝癌的重要相關抗原之一。我們以往研究發現，HBsAg修飾的樹突狀細胞（DC）瘤苗對肝癌荷瘤小鼠產生有較明顯的免疫治療作用，同時能夠誘導機體產生一定的抗肝癌免疫保護作用。但這種特異性的CTL效應還不夠理想，如何提高DC提呈抗原能力，成為進一步誘導的特異性CTL的關鍵。已有研究發現熱休克蛋白-70(HSP70)參與抗原提呈加工、協同免疫及自身免疫，可能是一種理想的疫苗增效劑［1］。本研究以HepG222.1.5肝癌細胞負荷小鼠模型，通過HSP70-HBsAg嵌合基因的重組腺病毒載體（Ad-HSP70-HBsAg）的介導，探討HSP70-HBsAg嵌合基因修飾DC瘤苗對肝癌動物模型的免疫治療效果，以期為HSP70-HBsAg嵌合基因修飾DC瘤苗治療肝癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株

C57BL／6J小鼠，雌性，6～8周齡，購自中山大學實驗動物中心。HepG222.1.5細胞系為整合HBV基因的肝癌細胞系，能夠穩定表達HBsAg和分泌HBV DNA，由南方醫科大學附屬南方醫院感染科惠贈。

1.2 主要試劑

重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白介素-4（rmIL-4）、重組小鼠白介素-2（rmIL-2）和重組小鼠腫瘤壞死因子（rmTNF-α）購自深圳晶美公司。 RPMI 1640培養液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶消化液和青霉素/鏈霉素購自Life Technologies公司。絲裂霉素C（Mitomycin C）、G418、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、刀豆蛋白A(concanavalin, ConA)購自Sigma公司。腺病毒載體Ad-HSP70-HBsAg由本室自行構建［2］。

1.3 小鼠骨髓樹突狀細胞的體外培養

參考Inaba［3］等方法并稍作改進，拉頸處死C57BL／6J小鼠，無菌取小鼠的股骨、脛骨，用PBS液清洗股骨、脛骨3次。剪開股骨、脛骨的兩端，用PBS液沖出骨髓細胞，收集骨髓細胞懸液，用紅細胞裂解液(Tris NH4Cl)處理后，于300g（離心力），離心10min。以含10%FBS RPMI-1640培養液調整細胞的密度為2×106/ml，加入到6孔培養板中，每孔2ml，于37℃、5%CO2孵箱孵育2h，輕輕吸棄未粘附的懸浮細胞，用RPMI-1640液沖洗3次去掉未粘附細胞，再加入2ml含細胞因子rmGM-CSF(100ng/ml)和rmIL-4(50 ng/ml)的完全RPMI 1640液，于37℃、5%CO2孵箱中進行培養。隔天半量換液1次，補加細胞因子。于第7天，添加5ng/ml rmTNF-α，繼續培養至第12d，收集懸浮細胞為成熟的DC細胞。

1.4 HBsAg--HSP70-DC瘤苗的制備［4］

按上述方法分離小鼠骨髓細胞，進行DC誘導培養，于培養的第5天時加入200μl腺病毒Ad-HSP70-HBsAg(1×107病毒／m1)，于37℃、5%CO2孵箱中進行培養，病毒感染后第一天，將培養液體上清去除，加入含細胞因子新鮮培養液繼續培養，以后隔天半量換液1次，繼續培養至第10天，收獲細胞。

1.5 荷瘤小鼠模型的建立

正常C57BL／6J小鼠隨機分成3組（每組10只），將對數生長期的HepG222.1.5肝癌細胞接種于小鼠右后腿根部外側腿(5×105細胞／只，0.2mL/只)，建立荷瘤小鼠模型，每2～3天觀察一次腫瘤生長情況。

1.6 HSP70-HBsAg-DC瘤苗對實驗性肝癌的治療

1.6.1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗回輸途徑比較及對荷瘤小鼠的治療效果

按1.5方法建立的荷瘤小鼠模型，7d后分別通過瘤體內(intra-tumor)注射，皮下(hypo-derma1)注射或尾靜脈(intravein)注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)，7d后再加強免疫治療1次，每2d～3d觀察一次腫瘤生長情況，測量相互垂直的最大徑，以面積表示腫瘤大小，記錄腫瘤生長曲線。

1.6.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫治療效果

將對數生長期的HepG222.1.5肝癌細胞接種于小鼠腿部皮下(5×105細胞／只)，隨機分3組，每組10只，7 d后采用最佳免疫治療途徑，分別注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)、未轉染DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)，7d后再加強免疫治療1次，每2～3d觀察一次腫瘤生長情況，測量相互垂直的最大徑，以面積表示腫瘤大小，記錄腫瘤生長曲線，共觀察36d。

1.7 HSP70-HBsAg-DC瘤苗對實驗性肝癌的免疫保護性作用

正常C57BL／6J小鼠隨機分成3組（每組10只），經HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)、未轉染DC瘤苗(1×106細胞／只，0.2mL/只)分別皮下注射免疫2次，間隔7d，于第2次免疫后7d，分別從皮下接種對數生長期的HepG222.1.5肝癌細胞，觀察瘤體生長情況,共觀察36d。

1.8 統計學處理

使用SPSS12.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均值±標準差(±s)表示，資料采用方差統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同途徑注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對荷瘤小鼠模型治療效果比較

我們首先比較了HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途徑回輸后的抗腫瘤效應。分別通過皮下、尾靜脈、瘤體內注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對荷瘤小鼠模型治療，36天內腫瘤大小變化見表1。可以看出，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長明顯緩慢，經方差統計分析，皮下、尾靜脈、瘤體內注射三組之間比較有明顯差異（F=18.2253，P＜0.01），兩兩之間比較：瘤苗皮下注射組與瘤體內注射組比較，q＝8.5382，P＜0.01，有明顯統計學差異；皮下注射組與尾靜脈注射組比較，q＝4.2827，P＜0.01，有明顯統計學差異；瘤體內注射組與尾靜脈注射組比較，q＝4.2555，P＜0.01，有明顯統計學差異。根據統計學結果，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組明顯優于瘤體內注射組、尾靜脈注射，提示最佳免疫治療途徑為皮下注射途徑。因此，我們采用皮下注射途徑進行下列各項實驗研究。

表1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途徑回輸后腫瘤在體內的生長大小比較(mm2)

2.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫治療效果分析

從表2可見，采用皮下免疫治療，HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長明顯緩慢，HBsAg-DC瘤苗組次之，未轉染DC組腫瘤的生長速度最快，提示采用皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對實驗性肝癌有一定的免疫治療作用。經方差分析，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉染DC組三組之間比較有明顯差異（F=25.8472，P＜0.01），兩兩之間比較：HSP70-HBsAg-DC組與HBsAg-DC組，q＝3.4595，P＜0.05，有明顯統計學差異；HSP70-HBsAg-DC組與未轉染DC組比較比較，q＝10.0102，P＜0.01，有明顯統計學差異；HBsAg-DC組與未轉染DC組比較，q＝6.5506，P＜0.01，有明顯統計學差異。因此，采用皮下免疫治療，HSP70-HBsAg-DC組優于HBsAg-DC瘤苗組、未轉染DC組(P＜0.05)。

表2 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未轉染DC回輸后腫瘤在體內的生長大小比較(mm2)

2.3 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接種后對HepG222.1.5細胞攻擊的免疫保護作用

免疫小鼠對HepG222.1.5肝癌細胞再次攻擊的抵抗作用如表3所示，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫小鼠能有效抵抗HepG222.1.5腫瘤細胞的再次攻擊，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接種后，腫瘤的生長受到明顯抑制，瘤體出現延遲，同時生長減慢，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉染DC組三組間36天內腫瘤大小變化分別為：(11.08±5.61)mm2、(33.12±11.67)mm2、(63.31±28.92)mm2，未轉染DC對HepG222.1.5細胞攻擊的保護作用明顯減弱，而未轉染DC組對HepG222.1.5細胞的攻擊保護作用很弱，所有小鼠均長出腫瘤。經方差分析，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉染DC組三組之間比較有明顯差異（F=20.5431，P＜0.01）。提示HBsAg-DC瘤苗免疫接種對肝癌細胞有一定的免疫保護作用。

表3 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未轉染DC對HepG222.1.5細胞攻擊的免疫保護后腫瘤在體內的生長情況比較(mm2)

3 討論

近來研究發現，DC瘤苗注射途徑對誘導全身性免疫應答意義重大［5-6］。DC瘤苗的輸入途徑可能決定了細胞免疫能否發生及發生的強弱。有文獻報道用111In標記的DC分別經靜脈、皮下和皮內途徑 注入患者體內，發現靜脈注入的DC主要分布于肝臟、脾和骨髓,而皮內注入的DC快速移至局部淋巴結［7］。Fong等［8］將體外致敏的DC分別采用皮內、淋巴管及靜脈三種不同的途徑輸入前列腺癌患者體內，發現三種途徑雖然均能誘導抗原特異性T細胞免疫應答,但反應程度各不相同。經皮內和淋巴管途徑能產生高水平的TNF-γ，更易誘導Th1 應答，動物實驗表明，皮內和皮下注射DC比靜脈注射更易誘導CTL反應。皮下免疫DC瘤苗傾向于產生Th1型免疫應答，而靜脈注射DC瘤苗傾向于Th2型免疫應答［9］。由于皮下注射使用方便，無輸液反應且易誘導Th1應答，是使用DC瘤苗的較好途徑。

宋文剛等［10］采用皮下注射、靜脈注射和瘤體注射三種途徑回輸AFP－DC瘤苗，比較觀察AFP－DC瘤苗對荷瘤小鼠免疫治療作用，發現皮下注射AFP－DC瘤苗治療效果在抑制腫瘤生長、延長小鼠存活期方面都明顯優于瘤體內注射或尾靜脈注射。我們以往研究發現，采用皮下注射途徑注射HBsAg修飾的樹突狀細胞（DC）瘤苗，對肝癌荷瘤小鼠能夠產生特異性的CTL效應，延緩腫瘤的生長，但這種免疫治療還不夠理想，如何進一步這種提高特異性CTL的效應？研究發現DC、巨噬細胞等抗原提呈細胞表面存在熱休克蛋白（HSP）受體，熱休克蛋白70（HSP70）融合蛋白能夠刺激DC上MHCI、MHCII及B7分子水平，還可激活NK細胞，從而進一步達到增強免疫效果的作用。目前，HSP70被認為可能是一種理想的疫苗增效劑。為此，我們前期構建了攜帶HSP70-HBsAg嵌合基因的重組腺病毒載體，建立了攜帶HSP70-HBsAg嵌合基因的DC瘤苗，初步實驗發現，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長較靜脈注射組、瘤體內注射組明顯減慢。造成以上結果的可能原因：實驗動物皮下免疫DC瘤苗，能夠按照預期的目的進人引流淋巴結；實驗動物靜脈注射DC瘤苗后，DC首先聚集在肺臟、然后是肝臟、脾臟，它們不能有效的進入淋巴結，導致相應T細胞克隆的失能；瘤體注射DC瘤苗后，因腫瘤微環境產生免疫抑制因子影響DC發揮作用。

本實驗還發現，HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫的體內抗腫瘤效應明顯優于單純HBsAg瘤苗組和空白對照組，這可能與HSP70作為免疫優勢抗原誘導細胞和體液免疫，具有明顯的免疫佐劑效應相關［11］。本研究結果顯示，HSP70能夠增強免疫反應的作用，通過轉基因手段誘導抗肝癌腫瘤免疫，可能是一種具有潛在應用前景的生物治療方法。

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［4］雷春亮,歐陽玲,楊湛,等.腺病毒介導HSP70-HBsAg嵌合基因轉染樹突狀細胞及生物學特性分析［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志,2009,23(1):29-31.

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［8］Fong L,Broch stedt D,Benike C,et al.Dendritic cells injected viadifferent routes induce immunity in cancer patients［J］.J Immunol,2001,166:4254-4259.

［9］Timmerman JM，Levy R.Linkage of foreign carrier protein to a self-tumor antigen enhances the immunogenicity of a pulsed dendritic cell vaccine［J］.J lmmunol,2000,164:4797-4803.

［10］宋文剛,曲迅,李雅林，等.不同途徑免疫的AFP基因修飾DC瘤苗體內抗腫瘤效應的研究［J］.中國腫瘤生物治療雜志,2004,11(1):22-26.

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