液體培養的桑黃胞外多糖發酵培養基成分的優化

邵 杰，羅建光，曾曉雄,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

液體培養的桑黃胞外多糖發酵培養基成分的優化

邵 杰1,2，羅建光1，曾曉雄1,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

通過27-3IV部分因子設計(FFD)，對葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養因子進行篩選。在此基礎上，采用中心組合設計對部分因子設計，篩選出對桑黃胞外多糖產量的關鍵因子，確定培養基的

鮑氏層孔菌；胞外多糖；部分因子設計；中心組合設計

鮑氏層孔菌(Phellinus baumii Pilát)是重要的藥用真菌，其子實體俗稱桑黃。桑黃多糖是桑黃的主要藥效成分之一，具有提高機體免疫力、抑制腫瘤、降血糖、抗糖尿病等多方面的生物活性和藥理作用[1-7]。

傳統上，鮑氏層孔菌的活性成分多糖通常從子實體中提取；但由于鮑氏層孔菌野生資源(子實體)的日益匱乏，加之人工栽培周期長、難度較大，這已限制了對桑黃的進一步開發和利用。而液體深層發酵具有周期短、多糖產量高、條件控制容易、污染少、便于發酵下游加工處理以及工業化大規模生產等特點，是大量獲取活性多糖的理想途徑，因而通過液體發酵制備桑黃多糖備受關注[8-11]。然而，培養條件是液體發酵成功與否的關鍵因素。目前尚沒有關于采用數理統計方法優化鮑氏層孔菌胞外多糖培養條件的報道。為此，本研究采用部分因子設計(FFD)和響應曲面中的中心組合設計(CCD)，以桑黃胞外多糖產量為指標，對鮑氏層孔菌的培養條件進行優化，以期篩選出能高產鮑氏層孔菌多糖的培養基成分，為進一步開發鮑氏層孔菌資源提供依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

鮑氏層孔菌(P.baumii Pilát)購自中國林業微生物菌種保藏管理中心。

斜面培養基：綜合PDA培養基；種子培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、酵母膏1、KH2PO41、MgSO40.5、VB10.01，pH6.0；發酵培養基：按照實驗設計配制。

1.2 菌種培養及接種

取活化后的斜面試管菌種接入盛有100mL種子培養基的500mL三角瓶中，按照實驗設計，采用不同的培養基在溫度為28℃、pH值為6.0以及培養時間為5d的條件下，置往復式搖床中進行培養。

1.3 胞外多糖的制備

培養結束后，不同發酵條件下的發酵醪液在5000r/min進行離心20min，上清液經濾紙過濾后，濃縮至原體積的1/3，在4℃條件下用75%乙醇沉淀、過夜，經離心得到的沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次、干燥，得到桑黃胞外粗多糖[12]。采用苯酚-硫酸法測定胞外總糖含量。采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸法)測定還原糖含量。桑黃多糖的產量以每升發酵醪液中胞外多糖(EPS)的干質量進行計算，單位為g/L。

胞外多糖含量=胞外總糖含量ˉ胞外還原糖含量

1.4 培養基優化設計

根據藥用真菌生長所需營養要素的基本原則以及藥用真菌發酵影響因素的一般規律，結合近期的相關文獻報道[13-14]以及前期單因素試驗，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養因子進行考察，其優化步驟包括兩個階段：1)通過27-3IV部分因素設計(FFD)，對7個變量進行篩選，確定影響桑黃胞外多糖產量的關鍵因素；2)采用響應曲面設計中的中心組合設計對部分因素設計篩選出的有顯著影響胞外多糖產量的因素水平進行優化，最終確定培養基的組成和水平。采用Stat-Ease Design-Expert軟件(version7.1.3, Stat-Ease Corporation, USA)和SAS statistical package (Version 8.1, SAS Institute Inc., NC, USA)進行試驗設計、數據分析及模型的建立。

1.4.1 部分因子設計

選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨(C2H8N2O4)7個營養因子及其編碼水平設計見表1。

表1 27-3IV部分因子試驗設計因素編碼及水平Table 1 Coded and real values of the variables tested in 27-3IV fractional factorial design

1.4.2 中心組合設計

通過27-3IV部分因子設計，發現葡萄糖、酵母膏和草酸銨是影響桑黃胞外多糖產量的關鍵因素。采用全因素中心組合試驗設計對影響桑黃胞外多糖產量的培養基關鍵組成成分及其最佳水平進行探索。

2 結果與分析

2.1 部分因子設計及關鍵因子的確定

27-3IV部分因子設計見表2，包括16個試驗點和4個重復的中心點，在發酵培養6d、pH6.0、培養溫度28℃的條件下，測定其響應值桑黃胞外多糖產量。

表2 部分因子試驗設計及結果(n＝2)Table 2 27-3IV fractional factorial design and experiments results(n＝2)

在前期實驗工作的基礎上，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1以及草酸銨7個營養因子進行主因素分析。從表2可以看出，在不同的培養基成組合情況下，胞外多糖產量在0.59～2.38g/L之間變化。

表3 部分因子設計試驗結果的統計分析Table 3 Statistical analysis of the experimental results of 27-3IV fractional factorial design

對試驗結果進行方差分析(表3)，所選用的模型具有高度的顯著性(P=0.0314)，其校正相關系數R2=90.28%，表明此模型擬合度較好，所研究的7個因子僅有9.72%的桑黃胞外多糖產量總變異不能夠用此模型來解釋，表明該模型適合解釋和預測桑黃胞外多糖產量。該模型回歸系數顯著性檢驗表明葡萄糖(P=0.0111)、酵母膏(P=0.0381)、草酸銨(P=0.0115)、葡萄糖與酵母膏(P=0.0498)、葡萄糖與草酸銨(P=0.0179)、葡萄糖、蛋白胨與磷酸二氫鉀(P=0.0107)的交互作用對桑黃胞外多糖產量有顯著影響。因此，葡萄糖、酵母膏和草酸銨3個培養基成分被確定為影響桑黃胞外多糖產量的關鍵因素。

2.2 中心組合設計及響應面分析

根據部分因子設計的試驗結果，在中心組合設計試驗中，3個關鍵因素代碼及其中心點分別為葡萄糖(X1) 30g/L、酵母膏(X2) 4.5g/L、草酸銨(X3) 1.0g/L，而蛋白胨、硫酸鎂、KH2PO4和VB1等4個因素在FFD試驗統計分析中，在5%置信度上沒有顯著性，作為常量對待，取中間水平值分別為4、0.75、1g/L和0.0075g/L。

表4 中心組合試驗設計及其響應值(n＝2)Table 4 Central composite experimental design and results(n＝2)

表4列出三因素五水平的中心組合試驗設計及其響應值，包括20個試驗點和6個重復的中心點，發酵培養6d、pH值為6.0，培養溫度為28℃。表中自變量編碼方程為：χi=(XiˉX0)/ΔXi，式中χi為自變量編碼值，Xi為自變量水平實際值，X0為實驗水平中心點實際值，ΔXi表示各變量實際值與中心點值之差。運用Design Experts 7.1.3軟件和SAS軟件對實驗數據進行回歸分析，根據以式(1)擬合出二次多元回歸模型：

式中：Y為鮑氏層孔菌胞外多糖產量；β0、βi、βii、 βij分別表示常數項、一次項、二次項和交互項的系數；Xi、Xj表示兩個不同的變量(i≠j)。模型方程的擬合性質由決定系數R2及方差分析判定，統計顯著性和回歸系數顯著性進行F檢驗來檢測，P值取0.05、0.01兩個不同水平。

根據CCD試驗設計原理，利用Design Expert 7.1.3軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合，以Y代表桑黃胞外多糖產量為響應值，回歸方程為：

由表5可見，該回歸模型(P=0.0024)高度顯著，失擬項(P=0.3507)不顯著，表明該模型適合解釋和預測桑黃胞外多糖產量；而且模型的一次項(X1、X2、X3)、平方項(X12、X22、X32) 和交互項(X1X3)是顯著的。其校正相關系數R2=0.7458，說明由這3個因子及其二次項能解釋桑黃胞外多糖產量總變異的74.58%，模型擬合程度較好，可以利用該回歸方程確定最優的產桑黃胞外多糖的培養基成分。

表5 多元回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis for the established regression model

通過桑黃胞外多糖產量回歸模型方程所作的響應曲面圖及其等高線圖見圖1～3，通過該組圖即可直觀地評價出因素對桑黃胞外多糖產量影響的兩兩交互作用以及確定各個因素的最佳水平范圍。

圖1 葡萄糖和酵母膏交互影響EPS產量的響應曲面和等高線圖Fig.1 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and yeast extract concentrations on EPS production (C2H8N2O4 concentration = 1 g/L)

圖1 顯示了草酸銨質量濃度1g/L時，葡萄糖和酵母膏對桑黃胞外多糖產量的效應。葡萄糖既是菌體生長的碳源和能源，同時又是產物EPS重要組成成分。葡萄糖在培養基中具有重要作用，其質量濃度的變化直接影響EPS產量。當培養基中葡萄糖質量濃度較高時，胞外多糖產量隨著酵母膏質量濃度的增加而降低，這可能是由于較高質量濃度碳氮源導致太高的滲透壓，不利于菌體生長有關；而在低質量濃度時，EPS產量隨著酵母膏質量濃度的增加而增加。此外，等高線圖的形狀直接反應交互作用的強弱[15]。從葡萄糖和酵母膏交互作用的等高線圖c可以看出，二者之間存在一定的交互作用，但在P = 0.05水平上沒有差異顯著性。

當酵母膏4.5g/L時，葡萄糖和草酸銨對桑黃胞外多糖產量的交互作用影響的響應曲面和等高線圖見圖2。在低水平的葡萄糖質量濃度時(20～30g/L)，EPS產量隨草酸銨質量濃度的增加而增加；高水平的葡萄糖質量濃度時(30～40g/L)，EPS產量隨草酸銨質量濃度的增加而降低。葡萄糖和草酸銨交互作用的等高線圖呈橢園形，具有較強的交互影響。同時，高質量濃度的碳氮源增加了培養基的滲透壓，造成菌體生長遲緩或停滯，進而降低了EPS產量。

圖2 葡萄糖和草酸銨交互影響EPS產量的響應曲面和等高線圖Fig.2 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and C2H8N2O4 concentrations on EPS production ( yeast extract concentration = 4 g/L)

葡萄糖的質量濃度處于40g/L時，酵母膏和草酸銨對桑黃胞外多糖產量的交互作用影響的響應曲面圖和等高線見圖3。氮是構成重要生命物質蛋白質和核酸等的主要元素，是微生物生長繁殖所需的主要營養物。前期的研究發現酵母膏和草酸銨分別是產胞外多糖的鮑氏層孔菌液體發酵重要有機氮源和無機氮源。由圖3可見，酵母膏的質量濃度處于低水平時(3.0～4.5g/L)，胞外多糖產量隨著草酸銨的質量濃度增加而增加。當酵母膏的質量濃度處于較高水平時(4.5～6.0g/L)，隨著草酸銨的質量濃度增加，胞外多糖產量反而下降。這可能與酵母膏營養成分復雜、酵母膏與草酸銨的濃度過高，培養基組成的C/N比過低，培養基的滲透壓過高，造成菌體對氮源利用程度下降，不利于菌體生長代謝，從而導致胞外多糖產量降低。此外，酵母膏和草酸銨交互作用的等高線圖亦呈橢圓形，也具有較強的交互影響。

圖3 酵母膏和C2H8N2O4交互影響EPS產量的響應曲面和等高線圖Fig.3 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast extract and C2H8N2O4 concentrations on EPS production (glucose concentration = 30 g/L)

由圖1～3可知，3個響應曲面圖均存在極值點，對二次多元回歸方程(2)求極大值，即得桑黃胞外多糖產量的預測值為2.342g/L。對應的3個因素：葡萄糖、酵母膏和草酸銨的代碼值分別為0.41、0.34、ˉ0.23；相應的最佳質量濃度分別為：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、草酸銨0.88g/L。

為驗證回歸模型的可靠性和響應曲面的分析結果，將響應面實驗優化得到的培養基在相同的發酵條件下進行5次平行實驗，結果發現桑黃胞外多糖平均產量為(2.363 ± 0.04)g/L，與預測值(2.342g/L)吻合度較高。由此可見，用該回歸模型優化產胞外多糖的發酵培養基成分是可行的。

應用部分因子設計(FFD)和中心組合試驗設計(CCD)方法，優化了鮑氏層孔菌發酵生產胞外多糖的培養基。結果表明，在所選取的7個影響因素中，僅葡萄糖、酵母膏以及草酸銨3個因素的可信度＞95%，是影響胞外多糖產量的關鍵因素。進一步的響應面分析表明，在上述自變量分別為：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸銨0.88g/L時，桑黃胞外多糖產量達到最大值(2.363±0.04)g/L。

3 結 論

本研究首先利用部分因子設計，對影響桑黃胞外多糖產量的諸多相關因子進行了評價，成功的篩選出影響胞外多糖產量的主要影響因素，省時省力，快速有效。通過響應面中的中心組合設計建立了關鍵影響桑黃胞外多糖產量的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了因素水平，探討了各因素間的交互作用。通過對模型方程的3-D圖及其等高線圖進行研究發現，桑黃胞外多糖平均產量為(2.363 ± 0.04)g/L，與預測值(2.342g/L)吻合度較高。由此可見，將部分因子設計和響應面中的中心組合設計相結合優化微生物發酵條件是一種十分有效的方法。

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Optimization of Cultivation Conditions for Extracellular Polysaccharide Production by P. baumii Pilát

SHAO Jie1,2，LUO Jian-guang1，ZENG Xiao-xiong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

A 27ˉ3IVfractional factorial design (FFD) was employed to determine culture medium ingredients affecting extracellular polysaccharide (EPS) production by P. baumii Pilát, such as glucose, peptone, yeast extract, ammonium oxalate, KH2PO4, MgSO4 and thiamine (VB1). Glucose, yeast extract and ammonium oxalate were identified as key affecting factors, and their optimal levels were further investigated by means of a central composite design. The average EPS yield from 5 parallel fermentation experiments carried out using a culture medium (g/L) composed of glucose 34.12, yeast extract 5.01, peptone 4, MgSO40.75, KH2PO41, VB10.0075 and ammonium oxalate 0.88 was (2.363 ± 0.04)g/L, which was in substantial agreement with the predicted value (2.342 g/L). It can be seen clearly that the developed regression model is applicable for the optimization of culture medium for EPS production.

Phellinus baumii Pilát；extracellular polysaccharide；fractional factorial design；central composite design

TQ920.4

A

1002-6630(2012)03-0121-05

2011-05-01

安徽省教育廳高校自然科學研究項目(KJ2009B076)

邵杰(1968—)，男，講師，碩士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：shaoj9099@163.com

*通信作者：曾曉雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向為糖生物學與糖生物工程、酶工程、天然產物化學。E-mail：zengxx@njau.edu.cn

組成和水平。在葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸銨0.88g/L的條件下進行5次平行發酵實驗。結果發現桑黃胞外多糖平均產量為(2.363±0.04)g/L，與預測值(2.342g/L)基本相符。可見，用該回歸模型優化產桑黃胞外多糖的發酵培養基是可行的。