熱處理辣椒醬貯藏過程中殘留微生物分析

丁 文，汪先丁，高 鵬，楊 虎，趙 敏，孫 群,*

(1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

熱處理辣椒醬貯藏過程中殘留微生物分析

丁 文1，汪先丁1，高 鵬2，楊 虎1，趙 敏1，孫 群1,*

(1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

四川郫縣辣椒醬多采用熱處理控制微生物生長以延長貨架期，但熱處理后殘留微生物仍會導致辣椒醬腐敗。辣椒醬經80℃、30min熱處理后室溫貯藏120d期間檢測其中菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母數，分別采用16S rDNA和ITS序列鑒定分離的細菌和真菌菌株，并運用PCR-DGGE法分析貯藏終點辣椒醬中細菌群落結構。結果表明：熱處理后辣椒醬中微生物減少了90%以上，殘留微生物主要為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，在貯藏期內微生物數量則呈先上升后下降的趨勢；PCR-DGGE檢測發現貯藏終點辣椒醬中主要殘留細菌為乳酸菌(Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。因此，熱處理可使辣椒醬中部分微生物致死、亞致死或轉為“存活但非可培養” (viable but non-culturable，VBNC)狀態，但殘留的芽孢桿菌(Bacillus sp.)和乳酸菌可能導致辣椒醬的腐敗。有效控制芽孢桿菌將是延長辣椒醬貨架期的關鍵因素。

熱處理；貨架期；菌落總數；PCR-DGGE；VBNC

四川擁有享譽全國的四大菜系之一——川菜，而辣味無疑是川菜中的重要風味之一。四川郫縣地區不僅出產著名的郫縣豆瓣，也有優質辣椒醬生產。郫縣辣椒醬選用優良品種的紅辣椒，經切碎、攪拌、鹽封后發酵1～2月生產而成，產品具有獨特的風味，不僅供四川本地食用，也有銷往全國各地，甚至出口日本等國。然而，自然發酵的郫縣辣椒醬中微生物數量及其活性均較高，且辣椒醬鹽分一般不會太高(10%～15%)，因而在后期貯藏前需要采用適當手段(如80℃熱處理30min)進行微生物控制以保證其貨架期。但實際生產中熱處理效果有時不盡人意，依然存在貨架期不長的問題，所以對熱處理后辣椒醬中殘留微生物進行準確分析顯得十分重要，從而才能有的放矢地采用適當抑菌劑或改進滅菌方式，從而延長辣椒醬的貨架期。

對于食品中微生物的研究，傳統上采用培養法統計微生物數量并分離得到純培養菌株。研究發現，辣椒表面可分離得到Lactobacillus χylosus、Pediococcus acidilactici、Pediococcus pentosaceus、Rhodotorula mucilaginosa等[1]，而米曲霉、醬油曲霉、黑曲霉、魯氏酵母和鹽水四聯球菌等則是湖南永豐辣醬自然發酵過程中的主要優勢菌[2]。但是，傳統培養法往往在培養條件上受到限制，影響了分離培養的結果。近年來，隨著分子生物學方法的發展，聚合酶鏈式反應-變形梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術逐漸應用于食品中微生物的檢測。高秀芝等[3-4]運用PCR-DGGE技術研究發現Lactococcus lactis、Bacillus licheniformis、Bacillus pumilus等為傳統豆醬發酵過程中的優勢菌；張琦等[5]則對郫縣豆瓣自然發酵過程中的細菌群落結構變化進行了研究分析，從中發現了Staphylococcus χylosus、Lactobacillus plantarum、Weissella confusa等。楊虎等[6]曾運用培養法和16S rDNA-ARDRA分析研究了冷藏雞肉胴體中的細菌多樣性，但同時運用培養法和非培養法研究辣椒或辣椒醬尚未見報道。通過分子生物學方法和傳統分離培養法的結合，應能更加全面地反映辣椒醬中的微生物數量及群落結構。

本實驗通過對郫縣辣椒醬進行熱處理，研究其貯藏過程中微生物的數量變化，分離鑒定其中的可培養微生物，并結合PCR-DGGE技術進一步分析微生物群落結構，以期揭示熱處理對辣椒醬中微生物數量和種類的影響，以及貯藏中導致腐敗的主要殘留微生物的種類，從而為延長辣椒醬貨架期提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

辣椒醬由四川郫縣豆瓣廠提供。

0.85 %滅菌生理鹽水、1×TE Buffer (pH7.6)、1× TAE Buffer (pH8.5)；聚丙烯酰胺、尿素、甲酰胺(均為分析純) 上海捷倍思基因技術有限公司；TaKaRa TaqTMDR100AM 日本TaKaRa公司；2×Taq PCR MasterMix KT201 天根生化科技(北京)有限公司；Primer EU27F、1492R、ITS1、ITS4 美國Invitrogen公司。

DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業公司；S1000TMThermal Cycler PCR反應儀、Universal Hood II凝膠成像系統、DCODE Universal Mutation Detection SystemTM通用突變檢測系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 培養基

平板計數瓊脂(PCA)培養基[7]、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養基[8]、孟加拉紅培養基[9]、PDA和PDB培養基[10]。

1.3 方法

1.3.1 辣椒醬的處理與分裝

將盛有(300±0.1)g辣椒醬的500mL燒杯使用保鮮膜和雙層報紙封口，于80℃恒溫水浴30min并迅速冷卻以模擬實際工藝，期間監測辣椒醬中心溫度變化。另設未處理組。兩組辣椒醬均分裝入無菌PE袋(約15g/袋)。1.3.2熱處理辣椒醬微生物計數

在第1、7、14、20、40、60、120天各取3袋熱處理辣椒醬，另在第1天取3袋辣椒醬作為未處理組。無菌條件下從每袋稱取10g辣椒醬，加入90mL 0.85%滅菌生理鹽水，180r/min振搖30min，制成10倍稀釋液，并梯度稀釋成100倍和1000倍的樣品稀釋液。菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數分別參照文獻[7-9]。

1.3.3 熱處理辣椒醬微生物種類分析

1.3.3.1 微生物分離與基因組DNA的提取

根據菌落形態及預實驗時菌落總數的結果，選擇從熱處理辣椒醬第1、20、60、120天的菌落總數測定平板上挑取單菌落，劃線純化后選擇代表性菌株富集培養，取1.5mL培養液采用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA作為后續PCR反應模板。

1.3.3.2 細菌16S rDNA序列擴增

選用細菌16S rDNA通用引物Eu27F (5＇-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3＇)和1492R (5＇-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3＇)進行擴增。PCR反應體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶 0.25μL，引物各1μL，ddH2O 30.75μL，模板DNA 4μL。反應程序：94℃ 5min；94℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 90s，30個循環；72℃ 10min[6]。擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3.3 真菌ITS序列擴增

選用引物ITS1 (5＇-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3＇)和ITS4 (5＇-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3＇)。PCR反應體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl23μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，引物各1μL，ddH2O 31.75μL，模板DNA 4μL。反應程序：95℃ 5min；95℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，30個循環；72℃ 10min。擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3.4PCR-DGGE分析細菌群落

在第120天取適量辣椒醬制成10倍稀釋液，取1.5mL勻液500r/min離心2min，取上清液10000r/min離心5min，收集沉淀經改良的CTAB法[11]提取宏基因組DNA。

采用Nested PCR法。先用EU27F和1492R擴增細菌16S rDNA，反應程序同1.3.3.2節。然后用帶GC clamp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)的通用引物GC-338f (5＇-GC clamp-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3＇)和518r (5＇-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3＇)，經降落PCR擴增16S rDNA V3區，反應程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60～55℃ 30s (每個循環降低0.5℃)，72℃ 30s，10個循環；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 30s，25個循環；72℃ 10min[5]。PCR反應體系均為(50μL)：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物各1μL，ddH2O 19μL，模板DNA 4μL。16S rDNA擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測；16S rDNA V3區擴增產物用2%瓊脂糖電泳檢測。

細菌16S rDNA V3區PCR產物DGGE電泳、染色及圖像分析參考文獻[5]。切膠回收代表性條帶，加入40μL TE Buffer 4℃浸泡過夜，取上清為模板，用不含GC clamp的引物338f和518r再次擴增16S rDNA V3區，反應程序同上，反應體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，引物各1μL，ddH2O 29.5μL，模板DNA 5μL。

1.3.3.5 序列分析

PCR產物測序后提交NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)進行Blast相似序列檢索，并于GenBank獲得序列登錄號(Accession No.)。

1.4 統計分析

使用Excel 2003 SP3和SPSS Statistics 19.0軟件進行數據分析。使用ANOVA分析微生物數量變化的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 熱處理辣椒醬微生物計數結果

辣椒醬中心溫度在熱處理過程中呈上升趨勢，處理結束時達到最高溫度57℃。熱處理前后及貯藏過程中辣椒醬的菌落總數變化見圖1。熱處理后辣椒醬菌落總數由(5.25±0.05)(lg(CFU/g))降為(4.06±0.03) (lg(CFU/g))，說明80℃熱處理30min有效殺滅了辣椒醬中超過90%的微生物。菌落總數在處理后第7天達到貯藏期內的最大值(4.44±0.04) (lg(CFU/g))，相比第1天增加了約0.4 (lg(CFU/g)) (P＜0.05)。這可能是因為熱處理后雖有降溫處理但不夠徹底，且樣品堆積，從而導致了辣椒醬中殘留微生物的生長。但熱處理使辣椒醬中微生物鈍化或產生了其他不可修復的損傷，從而抑制了微生物大量增殖，因此菌落總數在第7～40天期間維持在一定水平，并從第60天開始下降，至第120天僅為(2.94±0.10) (lg(CFU/g))，相比第1天下降了1.12 (lg(CFU/g)) (P＜0.05)。菌落總數在貯藏后期的下降，可能是由于微生物逐漸死亡或是轉為“存活但非可培養”(viable but non-culturable，VBNC)[12]狀態。

另一方面，熱處理后辣椒醬中真菌數由72CFU/g降為不可檢出，說明熱處理對辣椒醬中真菌也有殺滅作用，而未滅菌處理的辣椒醬中真菌數量很少，推測真菌可能不是發酵中的功能菌群，也不是熱處理辣椒醬貯藏過程中的腐敗菌。

大腸菌群在熱處理前后均未檢出，產品符合農業行業標準NY/T 1070—2006《辣椒醬》。

圖1 熱處理辣椒醬貯藏過程中的菌落總數變化Fig.1 Total bacterial count in chili sauce before and after heat treatment

2.2 熱處理辣椒醬微生物的分離鑒定

表1 辣椒醬分離細菌16S rDNA序列分析Table 1 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from chili sauce

從熱處理辣椒醬中分離純化得到6株可培養細菌，16S rDNA鑒定結果見表1。可以看出，從熱處理辣椒醬中分離的可培養細菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，推測可能是由于Bacillus sp.細菌可形成芽孢從而逃避了熱處理的損害，從而大量存活。Bacillus sp.細菌可能是環境菌種，同時也具有一定的發酵和抑菌作用。有研究指出，細菌型豆豉發酵曲種主要是Bacillus subtilis，并且Bacillus subtilis和Bacillus amyloliquefaciens可產生具有顯著溶栓作用的豆豉纖溶酶[13]。高雅等[14]曾從自然發酵的郫縣豆瓣中分離得到一株Bacillus subtilis (L4)，該菌能有效抑制產毒黃曲霉的生長及毒素的合成。熱處理辣椒醬中未檢出真菌，但自處理前辣椒醬中分離得到1株酵母菌F1。經ITS序列分析比對，F1與菌株Rhodotorula mucilaginosa PYCC 4349 (AF444584)相似性達100%，序列提交GenBank并獲得登錄號JF338814。推測辣椒醬中的Rhodotorula mucilaginosa可能來自于原料辣椒[2]。相比其他微生物，Bacillus sp.細菌在熱處理壓力下具有更佳的存活能力，其數量在貯藏期內占據著優勢地位，具有潛在的致腐可能。但是，本研究采用的PCA培養基和培養條件(37℃、48h、非厭氧)只適合部分細菌生長，對于營養要求復雜、生長緩慢等生長條件要求嚴苛的細菌可能無法成功培養。此外，經熱處理作用，部分微生物細胞可能處于VBNC狀態，具有潛在的生長能力及危害性[15]，但也未能進一步驗證和檢出。這些因素都影響了微生物分離鑒定的結果。

2.3 辣椒醬貯藏終點細菌群落PCR-DGGE分析

第120天時辣椒醬細菌群落PCR-DGGE指紋圖譜見圖2，DGGE條帶經測序比對，序列鑒定結果表2。

表2 第120天辣椒醬細菌群落DGGE條帶比對分析Table 2 Identification of DGGE bands of bacteria isolated from chili sauce at day 120 of storage

由表2可知，辣椒醬貯藏終點第120天時的細菌群落主要為乳酸菌(Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.)。乳酸菌可能對于辣椒醬的獨特風味形成具有一定的影響，并可通過形成低pH值的環境抑制部分有害菌的生長。據報道，Lactobacillus brevis是自然發酵東北酸菜中的優勢菌[16]；Lactobacillus acidipiscis則曾在泰國豆醬中被發現[17]，而細菌群落中的Bacillus cereus則具有潛在的致腐性及致病性[18]。

與從辣椒醬中分離培養的細菌鑒定結果相比，DGGE圖譜中各條帶所代表的細菌種類更多。這一方面可能是由于在熱處理辣椒醬中Bacillus sp.細菌數量上處于優勢地位，在分離培養過程中抑制了Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.細菌生長，致使未獲得乳酸菌純培養菌株；另一方面也可能是由于Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.細菌在熱處理辣椒醬中處于死亡或是VBNC狀態而無法通過培養法檢測，僅能通過PCR-DGGE證明其存在于辣椒醬中。有研究指出，由于基于DNA的PCR-DGGE可能因死細胞的存在而產生誤差，而rRNA的合成與細胞的生長緊密相關，所以基于RNA的分析方法無疑更能提供關于微生物群落存活與代謝活性的有用信息。Han Yanqing等[19]對比了基于rDNA和rRNA的PCR-DGGE結果，顯示RNA-DGGE圖譜具有更高的微生物多樣性。

但另一方面，本研究的DGGE圖譜中僅出現1個條帶，經鑒定為Bacillus sp.細菌(Bacillus cereus，相似度99%)，多樣性小于培養法，這可能是由于使用通用引物338f和518r擴增16S rDNA V3區對于辨識Bacillus sp.細菌的檢測靈敏度不高，使得檢測存在一定的缺陷。Kim等[20]曾在研究中通過在16S rDNA擴增之后增加一輪選擇性PCR (引物pB和1492R)，然后選用引物Ec1055和GC-Ec1392擴增16S rDNA V9區，用于DGGE特異性檢測Bacillus sp.細菌，取得了很好的效果。

3 結 論

本實驗使用培養法和非培養法(PCR-DGGE)研究了熱處理辣椒醬中的殘留微生物，結果顯示，熱處理對辣椒醬中微生物的控制取得了一定成效，殺滅了辣椒醬中90%以上的微生物；但是，熱處理辣椒醬中的某些殘留微生物(如Bacillus cereus)仍然具有潛在的致腐性和致病性，控制殘留的芽孢桿菌才能更有效地延長辣椒醬的貨架期。

使用傳統的培養法檢測辣椒醬中的微生物，存在著培養基等條件上的限制，可能導致優勢菌(如芽孢桿菌)在檢測中大量生長；此外，某些微生物可能在熱處理后轉變為VBNC狀態而無法通過培養法檢出，這也使得培養法檢測結果往往不夠全面。而非培養法(PCR-DGGE)除了檢測出芽孢桿菌之外，還檢出了辣椒醬發酵過程中殘留的乳酸菌。因此，相比傳統上單獨使用培養法，非培養法(PCR-DGGE)與培養法的聯合應用，能夠更加全面地反映并準確監測辣椒醬中的微生物種類，可為選用適

當的抑菌劑或改進滅菌方式提供科學依據。

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Analysis of Microbial Survival in Heat-Treated Pixian Chili Sauce during Storage

DING Wen1，WANG Xian-ding1，GAO Peng2，YANG Hu1，ZHAO Min1，SUN Qun1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment, Ministry of Education, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. Sichuan Institute of Atomic Energy, Chengdu 610101, China)

Heat treatment is often used to inhibit microbial growth in Pixian chili sauce for extending its shelf-life, but some microorganisms are still likely to survive, causing Pixian Chili Sauce to spoil during storage. In this study, Pixian chili sauce treated at 80℃ for 30 min was enumerated for total aerobic bacteria, coliforms, moulds and yeasts during storage at room temperature for 120 days. Bacterial and fungal strains isolated from chili sauce were identified by 16S rDNA and ITS sequence analysis respectively, and PCR-DGGE technique was used to analyze the bacterial community at the end of the storage period. The total number of bacteria in chili sauce decreased more than 90% after heat treatment at 80 ℃ for 30 min, and the majority of surviving microbes were Bacillus sp. During the storage period of 120 days, the total number of bacteria in heat treated chili sauce increased at first and then decreased. The dominant surviving bacteria in chili sauce at the end of the storage period, as detected by PCRDGGE, were Pediococcus sp., Lactobacillus sp. and Bacillus cereus. These results demonstrate that partial microorganisms in chili sauce are killed or presented in VBNC (viable but non-culturable) state after heat treatment, and surviving Bacillus sp. and lactic acid bacteria may be the reason for the spoilage of heat-treated chili sauce. Consequently, effectively controlling the survival Bacillus sp. and lactic acid bacteria is the key to extend the shelf-life of chili sauce.

heat treatment；shelf-life；aerobic bacteria count；PCR-DGGE；viable but non-culturable (VBNC)

Q939.99

A

1002-6630(2012)03-0146-05

2011-04-18

國家科技人員服務企業行動項目(2009GJF00039)；四川省科技支撐計劃項目(2010NZ0051)；國際原子能機構(IAEA)支持項目(16356/R0)

丁文(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品微生物和食品安全。E-mail：davidting200518@yahoo.com.cn

*通信作者：孫群(1967—)，女，教授，博士，研究方向為食品微生物學和微生物技術。E-mail：qunsun@scu.edu.cn