DiversiLab系統沙門氏菌分子分型評價

許龍巖，袁慕云，林文麗，張 旺，焦 紅

(廣東出入境檢驗檢疫局技術中心食品實驗室， 廣東 廣州 510623)

DiversiLab系統沙門氏菌分子分型評價

許龍巖，袁慕云，林文麗，張 旺，焦 紅

(廣東出入境檢驗檢疫局技術中心食品實驗室， 廣東 廣州 510623)

目的：評價DiversiLab(DVL)系統對沙門氏菌(SA)的分型能力。方法：用rep-PCR技術為原理的DVL系統對進出口食品中分離的44株SA進行分子分型，并與脈沖場凝膠電泳(PFGE)結果比較，探討DVL對SA的種群分類能力和分辨率。結果：44株SA經rep-PCR分型分成22個群，分離自不同國家、不同食品中的相同血清型SA分布在同一個群，而且菌株之間相似性非常高。在rep-PCR結果中分在同一個群中的SA，在PFGE結果中除SA2和SA15外，其他菌株之間相關性較低。結論：DVL在SA的種群的分類能力上優于PFGE，但分辨率低于PFGE。

沙門氏菌；DiversiLab系統；rep-PCR；PFGE；分子分型

基因外重復回文序列(repetitive ext ragenic palindrome，rep)在細菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數量的差異，而序列本身在進化過程中又具有較強的保守性，非常適合作為PCR引物的擴增對象。在rep的中心有一段保守性很高的重復序列，根據這段重復序列設計引物，擴增兩段rep之間的片段，發展出了rep-PCR技術[1]。DiversiLab(DVL)是以rep-PCR技術為原理的自動化的分子分型系統。本研究用DVL對食品中分離的沙門氏菌進行rep-PCR分型，并與脈沖場凝膠電泳(PFGE)結果相比較，探討DVL對SA的分型能力，為DVL應用于SA的溯源工作提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 菌株

進出口食品中分離的SA 44株，菌株信息見表1。上述菌株為廣東出入境檢驗檢疫局技術中心食品實驗室和中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所保存菌株，所有菌株均經過API 20E生化鑒定確定為SA。PFGE相對分子質量標準用布倫登盧普(Braenderup)沙門氏菌H9812，由廣東省疾病預防控制中心贈送。

1.2 試劑與儀器

API 20E、rep-PCR試劑盒、微流體芯片 法國梅里埃公司；限制性內切酶Xba I 美國Promega公司；蛋白酶K 德國Merck公司；SeaKem Gold瓊脂糖、SLS(Sodium lauroyl Sarcosine)、SDS、EDTA 美國Sigma公司。

Agilent Bioanalyzer 2100型DVL分型系統 美國Agilent公司；PTC-200型PCR儀、CHEF MAPPER脈沖場電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

圖1 44株沙門氏菌rep-PCR分子分型樹狀圖和矩陣圖Fig.1 Dendrogram and matrix diagram constructed by rep-PCR molecular typing

表1 44株沙門氏菌菌株信息Table 1 Details of 44 Salmonella isolates investigated in this study

1.3.1DNA提取

刮取血瓊脂平板上分離純化的SA菌落，使用DVL配套核酸提取試劑盒，按照說明書推薦步驟提取DNA，DNA質量濃度控制在25～50ng/μL。

1.3.2rep-PCR分型

以提取的SA DNA為模版，使用DVL 配套的rep-PCR試劑盒，按照說明書進行PCR擴增，PCR循環參數為：94℃、2min；94℃、30s，50℃、30s，70℃、90s，35個循環；72℃、3min，反應體積為25μL。

PCR擴增產物注入微流體芯片放入DVL系統進行電泳，DVL自動生成分析報告，包括聚類分析樹狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖、菌株之間相似度。DVL根據Pearson相關系數確定菌株間的距離矩陣，用非加權配對算術平均法(Upgma法)建立樹狀圖。

1.3.3rep-PCR分型與PFGE分型比較

44株SA中選24株進行PFGE，PFGE方法按文獻[2]進行。限制性內切酶用XbaⅠ。產生的電泳圖用BioNumerics軟件構建聚類分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.144 株SA rep-PCR分型結果

44株SA 經rep-PCR分型分成22個群，由圖1可見，分離自不同國家、不同食品中的相同血清型的SA分布在同一個群，而且菌株之間相似性非常高。鼠傷寒沙門氏菌SA4、SA6、SA27、SA31、SA36分別從歐洲凍豬肚、廣東凍雞、歐洲豬舌、丹麥凍豬后腳、廣東羅非魚中分離，5株SA在聚類圖上分布在第4群，而且菌株之間的相似度在97%～99%。不同時間從歐洲凍豬肚中分離的德爾卑沙門氏菌SA2、SA5、SA29 和廣東凍豬肚中分離的SA15分布在第2群，菌株之間相似度在95.1%～97.9%。相同的現象在其他血清型SA中也發現，烏普沙拉沙門氏菌SA10、SA11、SA13分布在第6群；阿貢納沙門氏菌SA1、SA16、 SA35分在第1群，菌株之間相似度97.8%～98.5%；姆班達卡沙門氏菌SA22和SA23分布在第5群，伊斯坦布爾沙門氏菌SA18、SA38分布在第20群。

2.2SA rep-PCR與PFGE分型結果比較

24株SA經PFGE，根據電泳產生的條帶位置和數量的不同，共分為22個PFGE型，帶型較分散。由圖2可見，德爾卑沙門氏菌SA15、SA2和烏普薩拉沙門氏菌SA13之間的相似度達到100%，3株SA有相同的PFGE型，相似度達到100%。分析PFGE型相同而且同源性100% 的SA13、SA2、SA15菌株在rep-PCR圖上的分布，發現3株菌株在rep-PCR樹狀圖上分布在不同的群中。德爾卑沙門氏菌SA2、SA15在第2群，烏普薩拉沙門氏菌SA13在第6群，而且在樹狀圖的空間距離上與前兩株菌相隔較遠，表現出不相關性。這可能是SA13、SA15、SA2對限制性內切酶XbaⅠ有相同的酶切位點，3株SA有相同的PFGE型但有不同的rep-PCR型。分析鼠傷寒沙門氏菌在PFGE和rep-PCR中的分布，SA4、SA6、SA27、SA36在rep-PCR圖上均分布在第4群，SA4和SA6菌株之間同源性為97.8%，SA27和SA36同源性達到98.3%，按rep-PCR判斷標準SA4和SA6、SA27和SA36菌株間是不可分辨的關系，但PFGE結果，SA4和SA6之間是緊密相關菌株，SA27和SA36之間是不相關菌株。相同的現象在阿貢納沙門氏菌SA16和SA1之間也發現，兩株菌株在rep-PCR圖上分在第1群，菌株之間相似度98.5%，是不可分辨的菌株，但PFGE結果兩株菌株的相似度83.3%，相關性較弱。

圖2 XbaⅠ酶切24株沙門氏菌PFGE聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram constructed by PFGE cluster analysis based on Xba I digestion

3 討 論

rep-PCR已經被認為是一種細菌分型的有效方法，rep-PCR已經被商業化成為一個自動化模式，即DiversiLab系統[3]。Healy等[3]在一次對爆發和非爆發相關的不同血清型腦膜炎奈瑟菌進行的分析中發現，DiversiLab系統表現出了極其優秀的血清型和物種水平鑒別能力。Cangelosi 等[4]用DiversiLab系統對結核分枝桿菌和鳥型分枝桿菌進行分型時，產生其他方法不能分型的分枝桿菌的指紋，本研究用DVL系統對不同來源的SA進行rep-PCR分型，結果相同血清型的菌株分布在同一個群。5株鼠傷寒沙門氏菌SA4、SA6、SA27、SA31、SA36，4株德爾卑沙門氏菌SA2、SA5、SA29、SA15，烏普沙拉沙門氏菌SA10、SA11、SA13，阿貢納沙門氏菌SA1、SA16、SA35，姆班達卡沙門氏菌SA22、SA23，均分別分布在同一個群中。值得一提的是，與德爾卑沙門氏菌SA2、SA15 PFGE型別完全相同的烏普薩拉沙門氏菌SA13，在rep-PCR樹狀圖上并非與上述兩株菌株分在一個群，而是與相同血清型的SA10、SA11分在同一個群。DVL對SA種群分析時，是基于分類群之間的親緣關系進行分離，在SA種群的分類方面表現出較強的能力。

rep-PCR與PFGE分型結果比較發現，在rep-PCR樹狀圖中分在同一個群中的相同血清型SA在PFGE圖譜上并非分在同一個群，而且樹狀圖中相隔較遠、相似性較低。在rep-PCR圖譜判斷標準上，DVL的廠家建議菌株之間相似性大于97%、沒有條帶的差異，判斷為不可辨別的菌株；相似性大于95%、有1～2條不同的條帶，判斷為相似菌株；相似性小于95%、有多條不同的條帶，則判斷為不同菌株(DVL的rep-PCR圖譜不會給出100%的相似性)。曲燕燕等[5]按上述判斷標準用DVL對鮑曼不動桿菌進行分子分型，Healy等[6]也用上述標準對阪崎腸桿菌進行分群。本研究rep-PCR圖譜中分在同一群中的相同血清型SA之間相似性均在97%以上，按照DVL判斷標準這些菌株之間是不可分辨的。但在PFGE結果中觀察，只有德爾卑沙門氏菌SA2、SA15是完全相同的菌株外，阿貢納沙門氏菌SA16和SA1、鼠傷寒沙門氏菌SA27和SA36、德爾卑沙門氏菌SA2和SA5，在樹狀圖上相隔較遠，彼此之間是不相關的菌株。這一觀察結果表明，rep-PCR在進行SA種群分類時比PFGE更優勝，但對同種菌株的分型分辨率上PFGE更優于rep-PCR。在實驗操作方面，DVL是自動化的rep-PCR分型系統，提供標準化的試劑和方法，對實驗人員的操作技能要求沒有PFGE高[7-8]。在分型時間上DVL系統可以在4h內自動化分析13個樣品，包括獲得聚類分析樹狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖等報告，而PFGE需要3～5d時間[9]?？傊?，在細菌的分型方法中，DVL系統是一種快速、簡便的分型方法，對SA的種群分類能力和分辨率也比較高，作為SA快速分型和溯源工具具有潛在的實用性。

[1]VERSALOVIC J, KOEUTH T, LUPSKI J R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Res, 1991, 19(24): 6823-6831.

[2]CDC. Standardized laboratory protocol for molecular subtyping of Escherichia coli O157:H7, non-typhoidal Salmonella serotypes,and Shigelloses sonnei by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)[EB/ OL]. [2011-03-01]. http://www. cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli-salmonella-shigella-protocols. pdf.

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Molecular Typing Evaluation of Salmonella in Diversilab System

XU Long-yan，YUAN Mu-yun，LIN Wen-li，ZHANG Wang，JIAO Hong
(Food Laboratory of Technology Center, Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China)

Objective: To evaluate the typing performance of DiversiLab system (DVL) for Salmonella. Method: A DVL system, which is based on rep-PCR, was used to type 44 Salmonella isolates from exported and imported foods and compared with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The Salmonella isolates were typed by rep-PCR into 22 groups. The same serotypes of Salmonella isolates from different countries and foods were distributed in the same group with a high similarity. The PFGE results obtained for Salmonella isolates assigned to the same group using rep-PCR indicated a low similarity among all other isolates except No. 2 and No. 15. Conclusion: DVL shows better typing ability but lower resolution for Salmonella than PFGE.

Salmonella；DiversiLab system；rep-PCR；PFGE；molecular typing

Q939

A

1002-6630(2012)03-0203-04

2011-03-27

廣東省科技計劃項目(2009B0600013)；廣東出入境檢驗檢疫局科研項目(2009GDK35)

許龍巖(1970—)，男，高級工程師，碩士，研究方向為食源性病原菌分子檢測。E-mail：xlyooo@sohu.com