A154C/G155C雙點突變對嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩定性的影響

柯 濤，劉 征，楊建偉，牛秋紅，惠豐立，石晴芳，馬向東

(1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南 南陽 473061；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

A154C/G155C雙點突變對嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩定性的影響

柯 濤1，劉 征1，楊建偉1，牛秋紅1，惠豐立1，石晴芳2，馬向東2

(1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南 南陽 473061；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

利用重疊延伸法對嗜熱球菌Thermococcus sp.的高溫酸性α-淀粉酶基因BD5088進行體外A154C/G155C雙點定點突變，通過原核表達載體pET30a構建表達載體pET-BD5088C2，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，酶學性質分析表明，突變淀粉酶拓寬了反應pH值范圍，尤其是酸性條件下提高更為顯著。BD5088淀粉酶在100℃條件下酶活力半衰期約為22min，而突變酶酶活力半衰期40min，突變酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加熱60min時，突變酶酶活力仍可維持原活力的40%，而BD5088淀粉酶只能維持20%左右。說明其熱穩定性得到有效的提高。另外，突變酶在中溫和90℃條件下酶活力有所提高，65℃時酶活力提高將近1倍。結果表明，BD5088淀粉酶的154、155位殘基的突變為Cys對維持其熱穩定性起到重要的作用，并且對其酶學性質有較大的影響，可能參與了二硫鍵的形成。

嗜熱耐酸淀粉酶；定點突變；熱穩定性；二硫鍵

淀粉是由葡萄糖基組成的高分子聚合物，是發酵、制糖等工業中最重要的原料之一。現在主要采用的工藝是雙酶法，包括兩個步驟：液化和糖化，液化過程現廣泛采用噴射液化，淀粉大顆粒經噴射液化器，在105～110℃的高溫下膠化，淀粉糊的自然pH值為3.5～4.2，因此液化過程需要將pH值調到6.0～6.2。在隨后的糖化過程中，糖化酶的最適作用溫度、pH值等均與淀粉酶不同。液化之后，需要將pH值調至4.2～5.0，溫度降為55～60℃，進入糖化過程。因此，目前對工業用淀粉酶，尤其是燃料乙醇生產專用淀粉酶的研究熱點集中在極端嗜熱酸性淀粉酶的研究上。

大部分α-淀粉酶屬于糖苷水解酶家族GH-13亞家族，盡管淀粉酶家族成員的活性不同，但他們都來自一個共同的祖先，由多結構域組成。所有家族成員都有TIM桶狀結構作為催化結構域 (A-domain)[1]。并且所有的酶也都有一個B結構域，位于A結構域的第3個β-折疊和α-螺旋之間。大部分超家族成員的催化結構域有相同的保守區段[2-5]。已知這些保守區域不僅與α-淀粉酶的催化活性有關，而且也與α-淀粉酶家族共有的桶狀三級結構的形成密切相關[6-7]。而不同的淀粉酶的B-domain的折疊類型差異較大，長度從34～104不等[8]。

Richardson等[9]從環境微生物DNA文庫中克隆到的一系列可能來源于一種嗜熱球菌屬(Thermococcus)的高溫酸性α-淀粉酶基因，并通過定向進化篩選到一個高溫酸性α-淀粉酶的人工突變體BD5088，在熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens獲得表達。基因BD5088全長1311bp，編碼437個氨基酸，蛋白質的理論分子質量約48kD，肽鏈上不存在任何潛在N-連接糖基化位點[9]。最適pH4.5，最適溫度95℃，活性不依賴于Ca2+存在，是一種高溫酸性α-淀粉酶，其綜合性質均優于其他淀粉酶基因，具有較大的應用潛力。為了能達到生產的目的，提高其熱穩定性和耐酸性，本實驗前期人工合成了BD5088基因，并在大腸桿菌中表達，研究表明其酶學性質與Richardson等[9]在熒光假單胞菌中獲得的重組蛋白有一些差異，其最適溫度和pH值范圍分別為80℃和pH5.6。以人工合成的BD5088基因為模板，通過蛋白質三維結構和氨基酸序列保守性的分析和其他幾個已知的耐高溫淀粉酶基因進行同源比對，在可變的B結構域選擇待突變的氨基酸位點，利用定點突變技術，進行定點突變，在大腸桿菌中進行表達，驗證其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)、T載體、大腸桿菌表達載體pET-30α 美國Invitrogen公司。

1.2 酶與試劑

BglⅡ、XhoⅡ、EcoRI、HindⅢ等限制性內切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶、回收試劑盒、抗生素、DNA marker、蛋白質分子質量標準及其他化學試劑 寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物合成和測序 上海Sangon公司。

1.3 培養基

篩選培養基是含100μg/mL卡那霉素的LB 瓊脂培養基。鑒定淀粉酶活性的培養基是在LB培養基的基礎上添加1%淀粉和0.01%曲利苯蘭[10]。

1.4DNA的提取及操作

質粒的快速提取、檢測及DNA的酶切、連接、大腸桿菌感受態的制備、轉化和表達產物的SDS-PAGE分析等按文獻[11]進行。

1.5 定點突變及重組質粒pET-BD5088C2的構建和鑒定

根據反向重疊延伸PCR (overlap extension PCR)原理，設計一對突變引物A154/G155f：5＇ATTGCATtgttgtGAC TCCGGAACCTTC3＇和A154/G155rev：5＇GGAGTCacaaca ATGCAATTCATTTGGG 3＇。其中小寫字母部分為突變位點。首先，以含有BD5088基因的質粒pET-BD5088為模板，用引物A154/G155f和A154/G155rev，94℃，50s；62℃，45s；72℃，7min (30個循環)，最后，72℃延伸10min，反向擴增得到包含載體序列和基因序列的線性片段，經過DpnⅠ酶消化模板后，膠回收，自連接，轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉化子，測序鑒定是否為突變基因，命名該突變基因表達載體為pET-BD5088C2。

1.6 重組蛋白的誘導表達和純化

將pET-BD5088C2、pET-BD5088和pET30a質粒分別轉化E. coli BL21(DE3)，挑取單菌落分別接種于2mL LB (Kanamycin+)液體培養基中，37℃培養過夜，按1%的接種量轉接于100mL培養基繼續培養到OD值為0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，30℃誘導表達4h后，4℃、12000r/min離心5min收集菌體，將菌體重懸于pH5.6、0.2mmol/L的磷酸緩沖液中，超聲波破碎(功率400W，超聲10次，每次10s)，4℃、12000r/min離心15min，分別取樣用于SDS-PAGE，檢測蛋白表達情況。超聲波破碎后上清經過90℃加熱后，離心去除沉淀，再用固化Ni2+樹脂進行純化后用150mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化的BD5088和雙點突變體A154C/G155C重組蛋白。

1.7 淀粉酶酶活力測定

純化后酶液用Yoo改良法[12]測定酶活力。酶活力單位定義為在最適反應條件下，每分鐘水解1mg的淀粉所需的酶量。

1.8 α-淀粉酶酶學性質研究

按照前期實驗結果，分別在不同溫度、pH5.6條件下測定酶活力，確定其作用的最適溫度。分別在不同pH值、80℃條件下測定酶活力，確定其作用的最適pH值。將酶液在95、100℃條件下分別處理不同時間，冰浴后再測定殘留酶活力，評價酶的熱穩定性。

1.9 序列分析和同源建模

通過BLASTP搜索比對，找出與BD5088高度同源的蛋白質序列和已知三維結構的同源序列，用CLUSTALW程序進行比對。三維結構建模采用已知三維結構的同源序列1MWO為模板，利用SWISS-MODEL程序進行同源建模[13]。利用Compare3D工具進行三維結構間的比較和比對[14]。利用ConSurf-DB工具進行氨基酸序列的進化保守性分析[15]。

2 結果與分析

2.1 定點突變位點的選擇

通過序列的同源比對，發現和BD5088高度同源的基因均為古細菌淀粉酶基因，同屬糖苷水解酶GH13家族，選取同源序列中已知三維結構的來源于Pyrococcus woesei的淀粉酶基因1MWO，進行三維結構的解析。通過氨基酸序列的進化保守性分析(http://consurfdb.tau.ac.il/, The ConSurf-HSSP database)，可以看出，高度保守的殘基大部分位于桶狀結構中間。而變異性高的殘基一般位于桶狀結構的外層、B結構域和C結構域中。從對淀粉酶家族的結構特征分析和催化活性位點分析，發現桶狀結構內部尤其是β-折疊內高度保守的氨基酸與淀粉酶催化活性和維持桶狀結構的穩定性密切相關。對這些氨基酸的突變往往導致催化活性的喪失。因此，突變目標首先選定為保守性相對較弱的氨基酸區域。

對幾個高度同源古細菌酸性淀粉酶間的氨基酸序列比對，BD5088與1MWO、Pfu_amylase、AAM48113分別有86.6%，86.5%和91.3%的同源性，具有較高的序列同源性。同時發現在154、155位點Pfu等3個高溫淀粉酶均為2個半胱氨酸，而BD5088淀粉酶則為A154/ G155，位于B結構域中(圖1)。根據對1MWO蛋白三維結構解析結果，推測此位點可能參與二硫鍵的形成，二硫鍵可加強淀粉酶的熱穩定性，而其周圍4個氨基酸分別為Zn2+和Ca2+結合位點。因此認為此位點的變化可能影響到該酶的熱穩定性等性質，本研究設計該位點為突變位點，構建雙位點突變體A154C/G155C，觀察該位點對酶活力和熱穩定性的影響。

圖1 BD5088序列同源比對結果Fig.1 Homologous alignment of BD5088 and other three amylases

2.2 突變基因A154C/G155C的獲得

以含有BD5088基因的質粒pETBD5088為模板，用引物A154G155f和A154G155 rev，進行反向重疊延伸PCR，反向擴增得到片段為6.7kb的包含載體序列和基因序列的線性片段(圖2)，經過DpnⅠ酶消化模板后，膠回收，自連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選重組子，測序證明獲得雙位點突變基因A154C/G155C。并獲得了含有該突變基因的表達載體pET-BD5088C2。 2.3突變蛋白的的誘導表達

圖2 反向重疊延伸PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretic patterns of reverse overlap extension PCR products

將重組質粒pET30a、pET-BD5088C2、pET-BD5088轉化到E. coli BL21(DE3)中，獲得重組菌株并進行誘導表達，超聲波破碎后取樣進行SDS-PAGE分析(圖3A)，表達出的目的蛋白分子質量約為48kD，大小與理論值一致，經過Ni+樹脂純化，得到純化后的重組酶(圖3B)。 2.4突變高溫酸性淀粉酶與BD5088淀粉酶的酶學性質比較研究

圖3 表達產物的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE of amylases from BD5088 and A154C/G155C

在pH5.6，不同的溫度條件下，測定BD5088和突變體A154C/G155C的酶活力，獲得溫度活力曲線。圖4A顯示，和BD5088淀粉酶相比，二者的最適反應溫度范圍相似，為70～85℃。60～100℃之間相對酶活力可保持50%以上。突變酶在中溫范圍的酶活力高于BD5088淀粉酶(圖4A)。

在80℃，不同pH值條件下，測定BD5088淀粉酶和突變酶的酶活力，獲得pH值-活力曲線，圖4B顯示，BD5088淀粉酶的最適pH值范圍為5.6～6.0，在pH值5～6.4之間，相對酶活力在90%以上，pH值4.6以下失活。而突變酶在pH5.6以上時酶活力特性與BD5088淀粉酶相同，在酸性范圍內其酶活力顯著優于BD5088淀粉酶，pH4.6時可維持酶活力的78%。

對BD5088淀粉酶進行熱穩定性分析，分別在100℃條件下，對酶進行加熱處理不同的時間。圖4C顯示，BD5088淀粉酶在100℃條件下酶活力半衰期約為22min，說明該酶有較好的熱穩定性。突變酶100℃條件下酶活力半衰期則提高到40min。加熱60min時，突變酶酶活力仍可維持原活性的40%。而BD5088淀粉酶只能維持20%左右。

圖4 A154C/G155C、BD5088淀粉酶的酶學性質研究Fig.4 Enzymatic characteristics of amylases from BD5088 and A154C/G155C

2.5 三維結構

BD5088與1MWO氨基酸順序有86.6%的同源性，三維結構同源建模的結果表明，BD5088淀粉酶和其突變體A154C/G155C在三維結構上與1MWO具有更高的相似度(圖5、6)。BD5088淀粉酶和突變酶三維結構區別不大。突變位點位于B結構域，因此對桶狀結構影響不大。實驗推測突變主要形成了二硫鍵，二硫鍵對蛋白結構和功能的貢獻主要在于熱穩定性上的提高，其溫度曲線未發生明顯改變。這符合研究熱穩定性提高的預期。

圖5 突變體的同源建模三維結構Fig.5 3D structure of A154C/G155C obtained by homology modeling

圖6 BD5088淀粉酶與A154C/G155C三維結構同源建模后突變位點的比較(局部)Fig.6 Comparison of partial 3D structures of A154C/G155C and BD5088 showing mutation positions

3 討 論

隨著化石能源的日益枯竭和環境污染的日益嚴重，如何降低利用作物生產燃料乙醇等發酵產品的能源消耗受到了世界各國的高度重視。以淀粉質為原料的液化和糖化工藝的幾個主要缺點就是pH值的反復調節、Ca2+的添加、105℃條件下淀粉酶活力的喪失，以及隨之而產生的后續處理工藝復雜等問題。解決上述問題的關鍵就是使用不依賴于鈣離子的超高溫酸性淀粉酶。顯然現有的耐高溫淀粉酶不能滿足上述工藝改進要求。針對以上特點，國內外對酶品種的改良方面的研究集中在耐高溫、耐酸性和非鈣離子依賴的淀粉酶的獲得上。雖然已經取得了一定的成效，但真正3個特性完全滿足、并有高轉化率的酶的商品化生產仍然是個空白。而我國的耐高溫淀粉酶方面的研制仍無法與同類型國外產品相抗衡。到目前為止，在GenBank中登錄的耐酸性耐高溫淀粉酶的基因大部分來源于極端嗜熱古細菌，在耐高溫淀粉酶的生產技術路線方面，現一般都采用基因工程技術手段，經過對極端環境微生物相關基因的蛋白質工程改造，并構建工程菌的技術路線，以避免原宿主菌難以培養或酶活力不高的缺點。目前已得到表達和細致研究，并在3種特性方面完全符合要求的淀粉酶基因還只有兩類基因，但距商品化應用仍有距離。因此，對此類淀粉酶的開發首先是相關的基因資源的開發和對現有基因的改造。國內多個課題組在原核和真核表達系統對此類基因進行了表達和研究[16]，但很少有人進行進一步的基因改造工作。

通過對雙突變體酶活力的檢測，我們發現該位點的突變影響到該酶的溫度、pH值特性和熱穩定性。兩個半胱氨酸的替換可能有利于該區域結構上的穩定，因此該突變體的熱穩定性和耐酸性都有所提高。突變酶100℃條件下酶活力半衰期可提高近1倍。而在酸性范圍內其酶活力也顯著優于BD5088淀粉酶，pH4.6時從BD5088淀粉酶的完全喪失活力提高到可維持最適酶活力的78%。酸性的有效pH值范圍從pH4.6擴大到pH3.8，比未突變酶擴大了0.8個pH值。因此該雙突變體酶完全符合液化工序中對高溫淀粉酶的工藝要求，本研究用定點突變提高淀粉酶熱穩定性及擴大酶作用有效pH值范圍，將有利于淀粉酶的工業化生產及應用。下一步工作我們可在此突變體基礎上進一步選擇其他突變位點，以提高其酶比活力等酶學特征，逐步達到生產的要求。

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Effect of Double Site-Directed Mutagenesis on Amylase Activity and Thermostability from Thermococcus sp.

KE Tao1，LIU Zheng1，YANG Jian-wei1，NIU Qiu-hong1，HUI Feng-li1，SHI Qing-fang2，MA Xiang-dong2
(1.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China；2.College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062, China)

Using overlap extension PCR, an A154C and G155C double site mutant named A154C/G155C was constructed based on the thermoacidophilic amylase gene BD5088 from Thermococcus sp. The recombinant plasmid pETBD5088C2 containing A154C/G155C was transformed into E. coli BL21 (DE3) for gene expression. The recombinant A154C/G155C amylase obtained showed a wider range of reaction pH, especially for acidic pH, than the amylase from BD5088. The half-life time of thermostability for the mutant at 100℃ was 22 min, almost doubling when compared with BD5088 (40 min). In addition, after heating for 60 min, A154C/G155C maintained 40% of its original amylase activity compared with 20% for BD5088, indicating an increase in thermostability. Moreover, the amylase activity of A154C/G155C increased at medium temperature or 90℃ and nearly doubled at 65℃. These results together with three-dimensional structure analysis indicate that mutation of the positions 154 and 155 to Cys in BD5088 is of great importance for maintaining the thermostability of amylase, has considerable effect on its enzymatic characteristics and may be involved in the formation of disulfide bonds.

thermoacidophilic amylase；site-directed mutagenesis；thermostability；disulfide bond

Q814.1

A

1002-6630(2012)03-0207-05

2011-02-21

湖北省教育廳重點課題資助項目(D20081004)；河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2011B180039)；南陽師范學院專項人才啟動基金資助項目(nynu200748)

柯濤(1970—)，女，副教授，博士，研究方向為酶工程、分子生物學。E-mail：ketao1@163.com