香菇發酵葛根生產總黃酮的工藝研究

劉金哲，史小青，姚艷飛，王 莘*

(吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

香菇發酵葛根生產總黃酮的工藝研究

劉金哲，史小青，姚艷飛，王 莘*

(吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

目的：研究香菇發酵葛根對總黃酮得率的影響。方法：通過單因素及正交試驗進行培養基篩選及發酵條件優化。結果：總黃酮得率較高的培養基配方(g/100mL)為：玉米粉2、蛋白胨0.2、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2；總黃酮得率最佳發酵條件：香菇菌種子液接種量5%、葛根添加量8g/100mL、溫度35℃、pH 7、轉速150r/min、發酵時間144h。結論：在上述條件下，香菇發酵葛根后總黃酮含量達到2.727mg/g，與對照組(不接香菇)比較含量提高了120.81%。

葛根；香菇；總黃酮；共發酵

葛根(Radiχ Puerariae lobatae)為豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)ohwi)的干燥根[1]，是常用的傳統中藥，屬于我國衛生部公布的藥食兩用資源，富含淀粉和黃酮類化合物。現代藥理研究表明，葛根總黃酮及單體葛根素是葛根的主要有效成分，具有維護心腦血管健康、降血脂、抗癌、抗衰老、增強機體免疫力等多種生理功能[2-6]。微生物發酵中藥是中藥研究的新方向和新內容[7-8]，其具有提高已知成分含量[9-10]，提高中藥藥效[11-12]，為中藥活性成分結構修飾[13]，降低毒副作用[14]等優勢，從而為保健食品和藥品工業提供更有價值、更實用的生產原料。

香菇(Lentinus edodes)具有生長繁殖力強，易于培養等優點，并在液體發酵過程中產生豐富的酶系，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，具有對木質纖維素、木質素、果膠等物質的分解利用能力[15-16]，有利于促進葛根中有效成分的釋放。本實驗對香菇發酵葛根產黃酮工藝進行探索，為提高葛根總黃酮得率提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌種由吉林農業大學生命科學學院生物工程實驗室保存；葛根由吉林省長春市宏檢藥店購買，已制成飲片。

1.2 培養基

斜面培養基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，pH值自然，121℃滅菌20min；種子液培養基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，pH值自然，121℃滅菌20min；基礎液體發酵培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，葛根添加量5g/100mL，pH值自然；115℃滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 香菇菌種子培養

斜面菌種活化2～3次后，在無菌條件下接至裝有200mL種子培養基的500mL三角瓶中密閉搖床培養，轉速150r/min、培養溫度28℃、培養時間48h。

1.3.2 基礎發酵

按5%接種量將香菇菌種子液接至基礎液體發酵培養基中密閉搖床培養，轉速150r/min、培養溫度28℃、培養時間288h(即12d)。確定香菇發酵葛根產總黃酮的最佳時間時，設不接種香菇為對照組。

1.3.3 葛根總黃酮的超聲輔助提取[17]及發酵液測定前處理[18-19]

將發酵一定時間的發酵混合物在70℃超聲提取30min，重復提取2次后，取一定量的發酵液，10000r/min離心10min除菌體，取上清液，用等體積無水乙醚萃取3次脫脂，脫色素，精密吸取水層0.5mL測定總黃酮含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

標準曲線的制作及總黃酮含量測定根據于村等[20]所述方法進行，得出回歸方程為：y＝0.107χ＋0.022，R2＝0.998。

1.3.5 培養基篩選實驗

1.3.5.1 培養基碳源篩選

基礎液體發酵培養基碳源分別替換為等量的玉米粉、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖，接種香菇菌種144h后，分別取不同碳源的發酵處理組進行總黃酮含量的測定。

1.3.5.2 培養基氮源篩選

基礎液體發酵培養基氮源分別替換為等量的蛋白胨、酵母粉、硝酸銨、尿素、硝酸鉀，接種香菇菌種144h后，分別取不同氮源的發酵處理組進行總黃酮含量的測定。

1.3.5.3 培養基篩選正交試驗[21-22]

在單因素試驗基礎上，進行正交試驗。以總黃酮含量為指標，選擇可溶性淀粉質量濃度、蛋白胨質量濃度、磷酸二氫鉀質量濃度、硫酸鎂質量濃度4個因素，設3個水平進行正交試驗，因素水平設計見表1。

表1 液體發酵培養基篩選正交試驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of culture medium ingredients for orthogonal array design

1.3.6 發酵條件優化的正交試驗

在基礎液體發酵培養基篩選試驗基礎上，進行發酵條件優化試驗。以總黃酮含量為指標，選擇種子液添加量、葛根添加量、溫度、初始pH值4個因素[23]，每個因素設3個水平進行正交試驗。

表2 發酵條件優化正交試驗因素水平表Table 2 Coded values and corresponding actual values of fermentation conditions for orthogonal array design

1.3.7 數據統計處理

實驗所得數據采用Statistical Product and Service Solutions數據統計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 香菇發酵葛根最佳時間的確定

圖1 不同發酵時間總黃酮含量比較Fig.1 Effect of fermentation time on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖1可知，對照組(不接種香菇)自振蕩處理144h開始，總黃酮含量由0.888mg/g開始逐漸增高，一直保持增長趨勢但是增幅較小，含量最高為1.235mg/g。香菇發酵葛根最佳時間144h總黃酮含量達最大值2.161mg/g。

2.2 培養基篩選單因素試驗結果

2.2.1 培養基添加碳源的比較結果

表3 不同碳源對香菇發酵葛根后總黃酮含量的影響Table 3 Effect of carbon source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

由表3可知，香菇發酵葛根培養基中添加不同碳源對香菇發酵葛根產總黃酮的產量不存在顯著性差異(P＞0.05)。從節約生產成本考慮，選用玉米粉為發酵培養基碳源。

2.2.2 香菇發酵葛根培養基添加氮源的比較結果

由表4可知，培養基中以玉米粉為碳源，添加蛋白胨為氮源有利于顯著提高香菇發酵葛根后總黃酮含量(P＜0.05)。

表4 不同氮源對香菇發酵葛根后總黃酮含量的影響Table 4 Effect of nitrogen source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

2.2.3 基礎液體發酵培養基篩選正交試驗結果與分析

表5 基礎液體發酵培養基篩選L9(34)正交試驗結果及分析Table 5 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing culture medium ingredients

從表5的R值可以看出，不同營養成分對香菇發酵葛根的影響次序為A＞C＞D＞B，最佳配方為A1B1C3D2，即：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氫鉀0.5g/100mL、硫酸鎂0.2g/100mL。采用最佳培養基配方進行驗證實驗，發酵后葛根總黃酮含量可達2.603mg/g。

2.3 發酵條件優化的正交試驗結果與分析

表6 發酵條件優化L9(34)正交試驗結果及分析Table 6 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing fermentation conditions

從表6的R值可以看出，不同發酵條件對香菇發酵葛根的影響次序為C＞D＞A＞B，溫度為最主要影響因素；最佳發酵條件為A1B2C3D2，即：香菇菌種子液添加量5%、葛根添加量8g/100mL、培養溫度35℃、初始pH值7。采用最佳培養基及最優發酵條件做驗證實驗，總黃酮含量可達2.727mg/g。

3 結 論

3.1 通過比較不同發酵時間的葛根經香菇發酵后總黃酮含量，發現接種香菇菌種后144h為香菇發酵葛根提高總黃酮含量的最佳發酵時間。發酵時間超過144h時總黃酮含量逐漸減少，與香菇的胞外酶(纖維素酶、果膠酶、淀粉酶)活性隨發酵時間變化的規律有較大相關性[24]。3.2對香菇發酵葛根這一復雜的發酵代謝過程而言，采用不同的考察指標，優化發酵條件的實驗結果可能是不同的，本實驗主要是研究有利于提高總黃酮含量的工藝，因此研究獲得的最佳培養基與發酵條件僅是在此指標下的優化結果，而針對其他代謝產物，需要進一步研究。最佳培養基配方為：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氫鉀0.5g/100mL、硫酸鎂0.2g/100mL。最佳發酵條件：香菇菌種子液接種量5%、葛根添加量8g/100mL、培養溫度35℃，初始pH值7。

3.3 最佳碳氮比的培養基，適宜纖維素酶解的溫度等對提高黃酮含量起積極作用[16]，本實驗采用優化后的培養基及發酵條件后，總黃酮含量達2.727mg/g，與不接種香菇對照組相比提高了120.81%。

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Optimization of Lentinus edodes Fermentation before Extraction of Total Flavnoids from Radiχ Puerariae

LIU Jin-zhe，SHI Xiao-qing，YAO Yan-fei，WANG Xin*
(School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To determine the effect of Lentinus edodes fermentation on the extraction efficiency of total flavonoids from Radiχ Puerariae and optimize culture medium ingredients and fermentation conditions. Methods: The optimization of medium ingredients and fermentation conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Results: The optimal medium composition (g/100 mL) consisted of corn meal 2, peptone 0.2, monopotassium phosphate 0.5, and magnesium sulfate 0.2, and the optimal fermentation conditions were inoculum amount of 5%, Radiχ Puerariae concentration of 8 g/100 mL, fermentation temperature of 35℃, fermentation pH of 7, rotation speed of 150 r/min, and fermentation time of 144 h. Conclusions: Under these conditions, the content of total flavonoids was 2.727 mg/g, which revealed a 120.81% increase compared with the control group (without the inoculation of Lentinus edodes).

Radiχ Puerariae；Lentinus edodes；total flavonoids；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)03-0212-03

2011-01-16

劉金哲(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物發酵與功能產品開發。E-mail：307754310@qq.com

*通信作者：王莘(1959—)，女，教授，碩士，研究方向為微生物發酵與功能產品開發。E-mail：wangxin5853@126.com