叔丁基對苯二酚兩種代謝物的代謝動力學

郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛玲

(1.首都經濟貿易大學安全與環境工程學院，北京 100070；2.北京大學環境科學與工程學院，北京 100871)

叔丁基對苯二酚兩種代謝物的代謝動力學

郝鵬鵬1，倪晉仁2，孫衛玲2

(1.首都經濟貿易大學安全與環境工程學院，北京 100070；2.北京大學環境科學與工程學院，北京 100871)

目的：研究叔丁基對苯二酚(TBHQ)在Sprague-Dawley大鼠體內的兩種代謝物叔丁基對苯二酚-硫酸結合物和叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結合物的代謝動力學特征。方法：大鼠灌胃不同劑量叔丁基對苯二酚后，采用液相色譜-質譜聯用法分別對兩種代謝物在不同時間點血清中的濃度進行半定量分析，并運用實用藥代動力學軟件進行房室模型擬合及代謝動力學參數計算。結果：兩種代謝物在大鼠體內的代謝動力學過程均呈一級動力學特征，符合二室模型。結論：灌胃后，叔丁基對苯二酚-硫酸結合物、叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結合物在大鼠體內達到峰值濃度的時間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h，分布相半衰期分別為0.32～1.11h、0.26～2.60h，消除相半衰期分別為11.75～24.54h、24.42～55.78h。雄性大鼠血清中兩種代謝物的濃度顯著高于雌性大鼠。兩種代謝物在大鼠體內的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，隨著劑量的升高，叔丁基對苯二酚在大鼠體內的代謝飽和。

叔丁基對苯二酚-硫酸結合物；叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結合物；代謝動力學；液相色譜-質譜聯用法

叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)是一種廣泛應用于油脂食品的合成酚類抗氧化劑(synthetic phenolic antioxidants，SPAs)。然而，其安全性評價結論一直存在爭議，體內實驗[1-2]和體外實驗[3-7]顯示TBHQ具有一定的毒性。此外，體內代謝研究發現TBHQ在體內的代謝物有TBHQ-硫酸結合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結合物、TBHQ-谷胱甘肽結合物和叔丁基對苯醌(2-tert-butyl-1,4-benzoquinone，TBQ)等[1,6,8]。其中，TBHQ-谷胱甘肽結合物已被發現對腎臟和膀胱有毒[9]，TBQ和TBHQ-谷胱甘肽結合物都具有細胞毒性[6,10]因此，TBHQ在食品中的添加引起社會廣泛關注[11]。目前，很多國家對其使用加以限制，我國規定TBHQ在食品中的最大添加量為200mg/kg[12]，而日本則不允許在食品中使用TBHQ[13]。

本實驗擬運用液相色譜-質譜聯用儀建立檢測大鼠血清中TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的分析方法，探討兩種代謝物在大鼠體內的代謝動力學過程，為深入研究TBHQ及其代謝物的毒作用性質進而評價TBHQ的安全性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年Sprague-Dawley大鼠，雌性和雄性，體質量(160±10)g，購自北京大學醫學部實驗動物部，合格證號SCXK(京)2002-0003。

TBHQ標準樣品(純度98.0%) 德國J&K Chemica公司；TBHQ(食品級，純度＞96.0%) 廣州泰邦食品添加劑有限公司；甲醇(色譜純) 美國Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

HP 1100 LC-MSD Trap SL System高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀(配有二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(diode-array detector，DAD)、電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)美國Agilent公司；BP210S、BP211D電子分析天平德國Sartorius公司；MILLI-Q GRADIENT SYSTEM超純水機 美國Millipore公司；WH-90A型微型混合器上海亞榮生化儀器廠；TGL-16C型高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 劑量與樣品采集

FAO/WHO食品添加劑聯合專家委員會(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)規定每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)為0～0.7mg/kg[6]。動物對毒性的耐受力比人強，約為人的1～10倍[14]。因此，選取7mg/kg作為低劑量。TBHQ的口服半致死量(LD50)為700～1000mg/kg[1]，因此選用700mg/kg作為高劑量。中等劑量選取低劑量和高劑量的中間值，定為350mg/kg。

雌、雄大鼠各24只，每6只一組，隨機分組：雌鼠A、B、C、D組和雄鼠A、B、C、D組。A組為空白對照組，以1mL玉米油灌胃；B、C、D組的劑量分別為7、350、700mg/kg，以1mL玉米油溶解后灌胃。大鼠灌胃后，分別于0.08、0.25、0.5、1、2、3、5、7、9、12、24、48h尾靜脈采血0.2mL。所采血樣放在冰盒中，置于4℃冰箱。

1.4 樣品前處理

空白血清：空白血樣在12000r/min離心20min，移取上清液到1.5mL具塞離心管中，即為空白血清。

血清供試品溶液：血樣在12000r/min離心20min，移取上清液100μL到1.5mL具塞離心管中，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入200μL甲醇，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取100μL上清液至內置100μL內插管的液相色譜進樣瓶內進行檢測。

血清標準溶液：用空白血清配制TBHQ質量濃度分別為49、228、581、1372、2515、5030μg/L的標準溶液，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入1mL乙酸乙酯，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取800μL萃取液至1.5mL離心管中，在25℃條件下由氮氣緩慢吹干，100μL甲醇定容，轉移至放有100μL內插管的液相色譜進樣瓶內，即得TBHQ血清標準溶液。

1.5 液相色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1mm× 150mm，5μm)，柱溫30℃，流動相為甲醇-水(體積比為60:40)，流速0.15mL/min，進樣體積5μL，檢測波長290nm，停止時間25min。

質譜條件：碰撞氣為氦氣，霧化氣和干燥氣為氮氣，霧化氣壓力30psi，干燥氣流速10L/min，干燥氣溫度280℃，毛細管電壓3000V，負離子檢測模式，質量掃描范圍m/z 50～450。

1.6 動力學模型計算

運用實用藥代動力學軟件(practical pharmacokinetic program-version 97，中國藥理學會數學專業委員會編制)分別對TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物在大鼠血清中的平均濃度-時間數據進行模型擬合，并估算各代謝動力學參數值，采用Excel軟件進行t檢驗或相關分析。

2 結果與分析

2.1 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的檢測

圖1 一級質譜總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of rat serum and extracted ion chromatograms of TBHQ, TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在所采用的液相色譜-質譜聯用條件下，TBHQ的保留時間為5.3min(圖1)，分子離子為m/z 165，二級質譜主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質譜裂解途徑詳見文獻[15]；TBHQ-硫酸結合物的保留時間為3.4min (圖1)，分子離子為m/z 245，二級質譜主要碎片離子為m/z 165、m/z 81，對m/z 165作三級質譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質譜裂解途徑見圖2A；TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的保留時間為3.4min(圖1)，分子離子為m/z 341，二級質譜主要碎片離子為m/z 113、m/z 165和 m/z 175，對m/z 165作三級質譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質譜裂解途徑見圖2B。

圖2 TBHQ-硫酸結合物(A) 和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物(B)的質譜裂解途徑Fig.2 MS fragmentation pathways of TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在研究TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的體內動力學過程時，與血清中濃度的絕對值相比，更為關注的是血清中濃度的相對變化。因此，在沒有代謝物標準樣品的情況下，利用TBHQ標準樣品建立標準曲線，對大鼠血清中兩種代謝物的質量濃度作半定量分析。質量濃度范圍為49～5030μg/L時，以TBHQ的一級質譜峰面積(y)為縱坐標，TBHQ的質量濃度(χ)為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為y＝703χ＋3582 (R2＝0.9935)，依據該方程和TBHQ-硫酸結合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的一級質譜峰面積分別求質量濃度，由此得出大鼠血清中TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的平均濃度-時間曲線(圖3、4)。此外，當灌胃劑量為700mg/kg時，雄性大鼠(n＝6)組有2只灌胃1～2h后死亡，雌性大鼠(n＝6)組則沒有死亡現象，據此推斷雌性大鼠對TBHQ的耐受能力更強。

圖3 血清中TBHQ-硫酸結合物的平均濃度-時間曲線Fig.3 Mean concentration-time profiles of TBHQ-sulfate in rat serum

圖4 血清中TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的平均濃度-時間曲線Fig.4 Mean concentration-time profiles of TBHQ-glucuronide in rat serum

2.2 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的代謝動力學

分別對TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物在大鼠血清中的平均濃度-時間數據進行擬合，結果表明：兩種代謝物在大鼠體內的代謝過程均符合一級吸收速率的二室模型，回歸系數(R2)分別為0.82～0.98、0.75～0.99。動力學方程為c＝Aeˉαt＋Beˉβt(A＋B)eˉKat。其中，c為TBHQ在大鼠血清中的濃度，α為分布速率常數，β為消除速率常數，A為α相在縱軸的截距，B為β相在縱軸的截距，Ka為一級吸收速率常數，t為時間。大鼠體內TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的主要代謝動力學參數值分別見表1、2。

表1 TBHQ-硫酸結合物在大鼠體內的主要代謝動力學參數Table 1 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-sulfate in rat serum

表2 TBHQ-葡萄糖醛酸結合物在大鼠體內的主要代謝動力學參數Table 2 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-glucuronide in rat serum

3 討 論

灌胃后，TBHQ在大鼠體內代謝生成TBHQ-硫酸結合物(t1/2Ka為0.04～0.26h)和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物(t1/2Ka為0.08～0.36h)；當時間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h時，兩種代謝物在血液中的濃度達到峰值；并且，從血液分布到體內其他組織或器官中(t1/2α(TBHQ-硫酸結合物)為0.32～1.11h、t1/2α(TBHQ-葡萄糖醛酸結合物)為0.26～2.60h)；最終，兩種代謝物從血液中消除(t1/2β(TBHQ-硫酸結合物)為11.75～24.54h、t1/2β(TBHQ-葡萄糖醛酸結合物)為24.42～55.78h)。

當灌胃劑量為7、350、700mg/kg時，分別對大鼠血清中TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的濃度進行性別差異分析，t檢驗結果均為P＜0.01。因此，在TBHQ的體內代謝過程中，大鼠血清中兩種代謝物的濃度存在著顯著性性別差異，雄性大鼠體內兩種代謝物的濃度均高于雌性大鼠。該差異是造成高劑量時雄性大鼠出現死亡的原因之一，仍需進一步的毒理實驗驗證。

運用Power模型[16]討論TBHQ-硫酸結合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結合物的體內暴露濃度(cmax)與劑量(c)間的關系，公式為lncmax=a＋blnc，c為劑量，b為體內暴露濃度-劑量的比例常數，b=1表示體內暴露濃度與劑量呈正比。經估算，在雌性、雄性大鼠體內，b(TBHQ-硫酸結合物)值分別為0.78、0.83，b(TBHQ-葡萄糖醛酸結合物)值分別為0.51、0.64。因此，當灌胃劑量從7mg/kg增至700mg/kg時，兩種代謝物在大鼠體內的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，劑量升高時，TBHQ的代謝反應受到參與反應的酶或底物的限制而出現代謝飽和現象。

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Metabolic Kinetics of Two Metabolites from Tertiary Butylhydroquinone

HAO Peng-peng1，NI Jin-ren2， SUN Wei-ling2
(1. School of Safety and Environmental Engineering, Capital University of Economics and Business, Beijing 100070, China；2. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China)

Objective: The metabolic kinetics of two metabolites from tertiary butylhydroquinone, tertiary butylhydroquinonesulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide were investigated in rats. Methods: The concentrations of the metabolites in the serum of rats after oral exposure of tertiary butylhydroquinone were semi-quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Compartment model and metabolic kinetic parameters were evaluated by practical pharmacokinetic program. Results: The serum concentration-time profiles of two metabolites could be fitted with a two-compartment model and obeyed first-order kinetics. Conclusion: After oral administration of tertiary butylhydroquinone, the peak time of tertiary butylhydroquinone-sulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide in the serum of rats were 0.17ˉ0.61 h and 0.23ˉ0.74 h, the distribution half-lives 0.32ˉ1.11 h and 0.2ˉ2.60 h, and the elimination half-lives 11.75ˉ24.54 h and 24.42ˉ55.78 h, respectively. The concentrations of two metabolites in the serum of male rats were higher than those in female rats. The exposure of two metabolites increased in a less-than-dose-proportional manner. Moreover, the metabolism of tertiary butylhydroquinone in rats reached saturation with increasing dose.

tertiary butylhydroquinone-sulfate；tertiary butylhydroquinone-glucuronide；metabolic kinetics；liquid chromatography-mass spectrometry

TS201.6；TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0220-05

2011-03-16

郝鵬鵬(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食品安全、環境衛生。E-mail：haopengpeng@gmail.com