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紅茶菌對寒冷誘導的小鼠SOD和LDH酶活力及丙二醛和谷胱甘肽含量的影響

2012-06-01 09:08:29張虎成張征田辛秀蘭
食品科學 2012年3期
關鍵詞:小鼠

張虎成,張征田*,辛秀蘭

(1.北京電子科技職業學院生物工程學院,北京 100029;2.南陽師范學院生命科學與技術學院,河南 南陽 473061)

紅茶菌對寒冷誘導的小鼠SOD和LDH酶活力及丙二醛和谷胱甘肽含量的影響

張虎成1,張征田2,*,辛秀蘭1

(1.北京電子科技職業學院生物工程學院,北京 100029;2.南陽師范學院生命科學與技術學院,河南 南陽 473061)

目的:通過研究超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)酶活力及丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量來探究紅茶菌發酵液是否能提高機體的抗寒能力。方法:以4組CD-1(ICR)小鼠,每組5只,分別連續30d灌注生理鹽水(對照組)、糖茶水(糖茶組)、紅茶菌發酵液(實驗組1)和合成培養基發酵液(實驗組2),每天灌胃1mL。以血液中的SOD和LDH酶活力及MDA和GSH含量為指標來研究小鼠抗寒能力。結果:與對照組相比,實驗組1和實驗組2受凍前后的SOD酶活力極顯著升高(P<0.01),MDA含量極顯著降低(P<0.01);實驗組1受凍前后GSH含量極顯著升高(P<0.01),實驗組2受凍后GSH含量極顯著升高(P<0.01);實驗組1和實驗組2受凍后LDH酶活力顯著降低(P<0.01)。結論:對照組和糖茶組不能提高小鼠抗寒能力,而實驗組1和實驗組2能提高小鼠抗寒能力,并且實驗組1效果好于實驗組2效果。

紅茶菌;抗寒能力;超氧化物歧化酶;乳酸脫氫酶;丙二醛;谷胱甘肽

紅茶菌是一種有著悠久歷史的民間傳統酸性飲料[1],目前仍然非常流行。紅茶菌是利用蔗糖和茶葉水發酵而來,實際上是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生體[2-3]。酵母菌主要有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、不顯酵母(S. inconspicus)、路德類酵母(S. ludwigii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),醋酸菌主要有木醋桿菌(Acetobacter χylinum)、擬木醋桿菌(A. χylinoides)、葡萄糖酸桿菌(Bacterium gluconicum)等,乳酸菌主要有保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulagricum)、嗜熱鏈球菌(Strepococcus thermophilus)、植物乳桿菌(L. plantarum)等[2-3,5,8-10]。共生體中的酵母菌將糖轉化成乙醇,醋酸菌將乙醇轉變成乙酸,最終導致培養基的pH值降低。發酵液含有糖、有機酸、咖啡因、VC、VB族及礦物質[1-2,11-12]。培養基中的茶葉為微生物提供必要的氮源,研究發現綠茶更有利于紅茶菌[13-14],主要是因為綠茶含有較高的咖啡因。

近些年國內外醫學界應用紅茶菌的實踐表明,紅茶菌能調節生理機能,促進新陳代謝,幫助消化,并能治療多種慢性疾病[1-6],紅茶菌能提高免疫力[7],具有明顯的抑制腫瘤作用[6]。最近紅茶菌的抗衰老作用日益成為國內外學者研究的重點[14],但是關于紅茶菌發酵液提高機體耐受力的研究報道較少[15]。研究表明,SOD[16]、LDH[17]、MDA[15]和GSH[18]與小鼠耐寒能力有一定的關系。為了尋找紅茶菌發酵液提高機體對寒冷耐受力更有力的證據,本研究采用優化工藝培養紅茶菌[14]和用合成培養基培養紅茶菌,通過測定SOD 和LDH 活力及MDA和GSH 含量來檢驗紅茶菌發酵液對小鼠抗寒能力的影響,以期為紅茶菌保健作用提供一定的理論參考,從而推進紅茶菌產業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SPF級CD-1(ICR)雄性小鼠20只,體質量18~22g,4~5周齡左右,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證編號:SCXK(京)2006-0008,合格證號:0208550。根據標準程序喂養小鼠。

紅茶菌購買于黑龍江,經鑒定為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生體;蔗糖(食品級)、綠茶(一級品) 市售。

SOD、LDH、MDA和GSH測定試劑盒 上海研生生化試劑有限公司;胱氨酸、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、CaCl2、FeSO4、酵母提取物等均為化學純。

AR2140電子分析天平 美國奧豪斯公司;LDZX-50KA高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;DTY-1360超凈工作臺 廣州市正一科技有限公司;CIMO 205恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;PHS-3C型精密酸度計 上海精密科學儀器有限公司;HH-S水浴鍋鄭州長城科工貿有限公司;RT-6000酶標儀 深圳市雷杜生命科學股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

實驗組1培養基:采用傳統培養基培養紅茶菌,紅茶菌培養液采用蔗糖、綠茶、蒸餾水為原料,按綠茶:蔗糖:水質量比1:100:1000配制。配制方法是:將沸水冷卻至85~90℃時,加入綠茶,保持20min,濾去茶渣,然后加入蔗糖混勻,分裝至500mL三角瓶中,每瓶裝液量200mL[14]。牛皮紙包扎后,進行巴氏消毒,冷卻到室溫備用。此培養基即為糖茶水。

實驗組2培養基:采用合成培養基培養紅茶菌,稱取K2HPO43.0g、KH2PO42.0g、蔗糖100g、(NH4)2SO41.0g、CaCl20.15g、FeSO40.1g、酵母提取物1.0g,加蒸餾水至1L,pH值為6.5,115℃高壓滅菌30mins,冷卻至室溫備用。

1.2.2 紅茶菌發酵液的制備

無菌條件下用傳統培養基(實驗組1培養基)和合成培養基(實驗組2培養基)培養紅茶菌,紅茶菌菌膜接種量為10g/100mL,(28±1)℃恒溫靜置培養,培養8~10d。每試樣3次重復。7000r/min離心30min,收集培養液上清,保存于ˉ20℃,備用。

1.2.3 實驗分組

隨機把CD-1(ICR)小鼠分成4組,即對照組、糖茶組、實驗組1和實驗組2,每組5只CD-1(ICR)小鼠。對照組以生理鹽水,糖茶組以糖茶水,實驗1組以傳統培養基培養的紅茶菌發酵液,實驗2組以合成培養基培養后的發酵液,分別按1.0mL/只,每天小鼠灌胃1次,連續灌胃30d。

1.2.4 寒冷誘導小鼠

灌胃30d結束后,每只CD-1(ICR)小鼠尾靜脈取血0.2mL。收集血液后,1000×g離心10min將血清和紅細胞迅速小心地分離,收集上清。立即用試劑盒分析血清中的SOD和LDH酶活及MDA和GSH含量。然后將小鼠置于10℃保持3h,立即取出室溫放置1h。每只CD-1(ICR)小鼠尾靜脈取血0.2mL,處理方法如前所述。每個數據重復3次。

SOD酶活力定義為25℃時1min內轉化1μmol底物的酶量定義為1個酶活力單位,亦即國際單位(IU)。LDH酶活力定義為在25℃、pH7.5條件下,1mL酶液中1min內能夠轉化1μmol丙酮酸至乳酸所需的酶量作為一個活性單位,亦即國際單位(IU)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 血液中SOD酶活力變化

表1 寒冷對4組小鼠血液SOD酶活力的影響(χ±s,n=5)Table 1 Effect of kombucha on serum SOD level in cold-stressed mice±s,n=5)IU/100mL

表1 寒冷對4組小鼠血液SOD酶活力的影響(χ±s,n=5)Table 1 Effect of kombucha on serum SOD level in cold-stressed mice±s,n=5)IU/100mL

注:**.與寒冷誘導前比較,有極顯著性差異(P<0.01);##.與對照組比較,有極顯著性差異(P<0.01)。下同。

組別寒冷誘導前寒冷誘導后對照組56.91±3.8243.67±2.56**糖茶組57.23±2.4444.58±3.12**實驗組165.26±2.72##62.48±1.36##實驗組264.19±3.83##60.26±1.95##

如表1所示,對照組受凍后SOD酶活力較受凍前SOD酶活力有顯著性降低(P<0.01);糖茶組具有類似的結果。說明無論是對照組還是糖茶組小鼠在寒冷狀態下體內消除自由基能力下降。糖茶組受凍前后SOD酶活力分別與對照組受凍前后相應數據相比,基本一致,無顯著性差異(P>0.05),說明單純飲用糖茶水不能提高機體血液中SOD的酶活力。

實驗組1受凍前的SOD酶活力與對照組相應數據相比,酶活力明顯提高(P<0.01),說明長時間飲用紅茶菌發酵液能夠增加機體SOD酶活力,有利于體內自由基的去除;同時,可以看出實驗組1受凍前后的SOD酶活力變化不大(P>0.05),說明長期飲用紅茶菌發酵液能夠提高機體在寒冷狀態下對體內自由基清除的能力。實驗組2亦然。

2.2 血液中LDH酶活力變化

表2 寒冷對4組小鼠血液LDH酶活力的影響(χ±s,n=5)Table 2 Effect of kombucha on serum LDH level in cold-stressed mice (χ±s,n=5)IU/mL

如表2所示,對照組受凍后LDH酶活力較受凍前LDH酶活力有極顯著升高(P<0.01);糖茶組具有類似的結果。說明無論是對照組還是糖茶組小鼠在寒冷狀態下體內糖酵解加劇,丙酮酸轉化成乳酸的速度加快,反映了體內能量和氧氣供應不足。糖茶組受凍前后LDH酶活力與對照組受凍前后相應數據相比,基本一致,無顯著性差異(P>0.05),說明單純飲用糖茶水不能有效降低血液中LDH酶活力。

實驗組1受凍后LDH酶活力遠低于對照組相應數據(P<0.01),說明小鼠即使在寒冷狀態下也沒有大量動用糖酵解來獲取能量,可能原因是體內儲存有足夠的ATP以供小鼠度過寒冷;實驗組1受凍前后LDH酶活力變化不明顯(P>0.05),說明長期飲用紅茶菌使機體能夠為寒冷狀態下的機體提供一定的能量,而不需要立即借助于糖酵解這種短效產生ATP的生能方式。實驗組2亦然。

2.3 血液中MDA含量的變化

表3 寒冷對4組小鼠血液MDA含量的影響(±s,n=5)Table 3 Effect of kombucha on serum MDA level in cold-stressed mice (±s,n=5)μmol/L

表3 寒冷對4組小鼠血液MDA含量的影響(±s,n=5)Table 3 Effect of kombucha on serum MDA level in cold-stressed mice (±s,n=5)μmol/L

注:++.與實驗組2比較,有極顯著性差異(P<0.01)。

組別寒冷誘導前寒冷誘導后對照組1.51±0.353.48±0.71**糖茶組1.43±0.563.25±0.53**實驗組11.08±0.24##1.22±0.63##++實驗組21.18±0.37##1.68±0.37##

如表3所示,對照組受凍后MDA含量較受凍前MDA含量有極顯著提高(P<0.01);糖茶組具有類似的結果。說明無論是對照組還是糖茶組小鼠在寒冷狀態下動用并分解了脂肪,產生了大量的MDA,進而損傷三羧酸循環和呼吸鏈中相關的酶,從而影響到ATP的供應。糖茶組受凍前后MDA含量與對照組受凍前后相應數據相比,基本一致,無顯著性差異(P>0.05),說明長期單純飲用糖茶水不能使機體儲存足夠的ATP以度過寒冷,仍然需要動用脂肪以產生ATP。

實驗組1受凍前后的MDA含量均低于對照組相應數據(P<0.01),特別是受凍后的MDA含量更遠低于對照組相應數據(P<0.01),說明體內即使分解了脂肪,并沒有產生過多的MDA或者MDA被及時清除掉。實驗組1受凍后的MDA含量比受凍前MDA含量有稍微上升,但無統計學差異(P>0.05),說明長期飲用紅茶菌發酵液能夠有效減低體內MDA含量,從而保護機體正常的代謝功能。實驗組2受凍前后的MDA含量均低于對照組相應數據(P<0.01),又高于實驗組1相應數據(P<0.01),說明紅茶菌發酵液中有未知成分比實驗組2更能夠降低MDA含量。

2.4 血液中GSH含量的變化

表4 寒冷對4組小鼠血液GSH 含量的影響±s,n=5)Table 4 Effect of kombucha on serum GSH level in cold-stressed mice (±s,n=5)mg/100mL

表4 寒冷對4組小鼠血液GSH 含量的影響±s,n=5)Table 4 Effect of kombucha on serum GSH level in cold-stressed mice (±s,n=5)mg/100mL

組別寒冷誘導前寒冷誘導后對照組34.51±1.3322.51±2.87**糖茶組35.26±2.4525.59±0.79**實驗組136.59±1.33##34.81±2.87##實驗組235.92±0.7333.54±1.48##

如表4所示,對照組受凍后GSH含量較受凍前GSH含量有極顯著降低(P<0.01);糖茶組具有類似的結果。說明無論是對照組還是糖茶組的小鼠在寒冷狀態下均產生了大量的自由基,導致了GSH含量降低,進而不能有效的清除體內自由基致使機體毒害加劇。糖茶組受凍前后GSH含量與對照組受凍前后相應數據相比,稍高,但無顯著性差異(P>0.05),可能是由于糖茶水中有生物堿可以增加體內GSH的含量。

實驗組1受凍前后的GSH含量波動不大(P>0.05),說明小鼠在寒冷狀態下產生的自由基不多,沒有明顯的使GSH含量降低,或者體內產生了足夠多的GSH及時清除了自由基。更重要的是,實驗組1受凍前后的GSH含量均高于對照組相應數據(P<0.01),特別是受凍后的GSH含量遠高于對照組相應數據(P<0.01),說明長期飲用紅茶菌發酵液能有效的清除體內的自由基,并能夠維持較高且穩定含量的GSH。實驗組2具有類似結果。

從上數據分析可知,長期飲用糖茶水,而非飲用紅茶菌發酵液,對于提高機體對寒冷的抵抗力,沒有明顯的作用。實驗組1和實驗組2兩組實驗數據得到同樣的結果,紅茶菌發酵液能顯著提高機體對寒冷的抵抗力。無論是實驗組1還是實驗組2在受凍前后的各種數據變化不大(P>0.05),說明紅茶菌發酵液能維持機體穩定的內環境;而對照組和糖茶組在受凍前后各種數據變化很大(P<0.01),說明單純飲用糖茶水不能維持機體穩定的內環境。由于SOD是清除體內自由基最主要的酶,體內SOD含量越高,清除體內自由基越快,自由基的含量就越低,對機體的傷害就越小,從而延長機體壽命。LDH是糖酵解時在氧氣不足情況下催化丙酮酸產生乳酸,乳酸的過量堆積對機體有一定的毒害作用。無論是實驗組1還是實驗組2與對照組和糖茶組相比,均說明經過紅茶菌中共生的微生物發酵后,培養液中產生了一些未知的物質,而不僅僅是生物堿,能夠顯著提高機體的免疫力、排毒能力及抗衰老能力。

3 討 論

寒冷對機體是一種有害的刺激因素,機體在寒冷狀態下為了維持正常的生命,通過神經內分泌系統等一系列應激反應導致腎上腺素和甲狀腺素分泌,引起機體采取與正常情況下不同的代謝方式,從而加速細胞氧化還原反應,促進體內糖、脂肪的分解以產生足夠的熱量來維持體溫正常。這些代謝方式主要以氧化還原為主,反應過程中產生了大量的自由基,包括O2·、·OH、NOˉ、和HOClˉ等。這些自由基會損傷細胞膜,侵襲大分子,誘發腫瘤生成或動脈粥樣硬化等疾病[19-20],從而減緩能量的供給。

SOD是體內重要的金屬酶抗氧化劑,催化自由基發生歧化作用,生成過H2O2和O2,防止細胞毒害。MDA反應了體內自由基累積水平[21],SOD催化活力及MDA的含量間接反應細胞衰老程度[21],與機體抗寒能力的強弱有關。紅茶菌發酵液能夠增加機體SOD酶活力,降低機體內MDA含量,增強機體抗寒能力。GSH是細胞內解毒劑,主要生理功能是清除自由基。紅茶菌發酵液能誘導體內產生大量的GSH,提高機體對自由基消除能力和對鉛、三氯乙烯等有毒物質的抵抗力[19],對機體起到強有力的保護作用。葡萄糖醛酸是紅茶菌發酵過程中產生的,具有解毒作用[21],能和體內的有毒物質結合并排除體外。本實驗沒有對發酵液中葡萄醛酸含量進行測量,發酵液中的葡萄糖醛酸含量是否與小鼠體內MDA呈負相關,有待進一步考察。LDH是一種糖酵解酶,存在于機體所有組織細胞的胞質內,檢測機體血清LDH可以診斷心臟休克、貧血及肝臟損傷等疾病[20]。本研究發現對照組小鼠寒冷誘導后LDH酶活力明顯高于實驗組1和實驗組2,說明小鼠在寒冷狀態下為了維持正常體溫,調動了大量的分解代謝,加快血液流動,可能引發心臟休克等短暫性行為;而實驗組1和實驗組2沒有明顯的變化。

本研究證實了小鼠長期灌注紅茶菌發酵液有助于體內自由基的清除,提高免疫力,這與相關文獻報道一致[19,22-23],也證實了長期灌注紅茶菌發酵液有助于提高小鼠對寒冷的抵抗力,同時也證明了傳統方法制備的紅茶菌發酵液的主要功能與茶葉中的生物堿沒有直接關系。目前,我們還不確定,紅茶菌發酵液能提高小鼠的免疫力及對寒冷的抵抗力是由紅茶菌發酵液產生的某種物質引起的,還是由較低的pH值引起的,這也是以后研究的一個方向。

紅茶菌是一種傳統的酸性飲料,通過本研究證明,經用飲用紅茶菌發酵液能提高機體對寒冷的抵抗力。紅茶菌的這種作用可能是由多種微生物發酵后產生的多種成分導致機體機能的提高引起的。對于紅茶菌發酵液中哪些確切的成分以及其相應成分的確切功能和機制,還有待進一步研究。

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Effect of Kombucha on Serum SOD, LDH, MDA and GSH Levels in Cold-Stressed Mice

ZHANG Hu-cheng1,ZHANG Zheng-tian2,*,XIN Xiu-lan1
(1.College of Biology Engineering, Beijing Polytechnic, Beijing 100029, China;2.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China)

Objective: The serum levels of superoxide dismutase (SOD), lactate dehydrogenase (LDH), malondialhyde (MDA) and glutathione (GSH) in cold-stressed mice were measured to discover whether kombucha enhances cold tolerance in mice. Methods: Twenty male CD-1(ICR) mice were randomly divided into 4 groups of 5 mice each: control group, sugary green tea infusion group, kombucha group I and kombucha group II, which were administered intrasgatrically with normal saline, sugary green tea infusion, culture supernatant from fermented sugary green tea infusion, and culture supernatant from fermented synthetic medium for 30 consecutive days at the dosage of 1 mL once a day, respectively. After the last administration, 0.2 mL of blood from the mice of each group were collected for the determination of serum SOD, LDH, MDA and GSH levels before and after the mice were kept in a cold chamber at 10 ℃ for 3 h. Results: The SOD levels of the two kombucha groups before and after the cold stress increased highly significantly compared with the control group (P<0.01), whereas the MDA levels showed a highly significant downward trend (P<0.01). GSH level revealed a highly significant increase (P<0.01) in the kombucha group I both before and after the cold stress and in the kombucha group II only after the cold stress. Both the groups showed a significant decrease in LDH level (P<0.01) after the cold stress. Conclusions: Both the kombucha groups rather than the control group or sugary green tea infusion group can enhance cold tolerance in mice. The kombucha group I is superior to the kombucha group II.

kombucha;cold tolerance;superoxide dismutase (SOD);lactate dehydrogenase (LDH);malondialhyde (MDA);glutathione (GSH)

R151.2

A

1002-6630(2012)03-0256-05

2011-03-31

北京市教委科研基地項目(PXM2010-014306-109857);北京市屬市管高等學校人才強教深化計劃項目(PHR201107151)

張虎成(1977—),男,講師,博士,研究方向為微生物次生代謝物。E-mail:huchengzh@yahoo.com.cn

*通信作者:張征田(1978—),男,講師,碩士,研究方向為次生代謝物功能及應用。E-mail:ztz0105@yahoo.com.cn

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