幾株酵母菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

王澤舉，王汝瑱，孫 悅，楊 瑩，劉延琳

幾株酵母菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

王澤舉，王汝瑱，孫 悅，楊 瑩，劉延琳*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

通過(guò)對(duì)酵母菌5.8S核糖體RNA的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增及限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP)的圖譜分析以和26S rDNA D1/D2區(qū)及5.8S-ITS區(qū)的序列分析，共鑒定13株分離自新疆鄯善地區(qū)的葡萄酒相關(guān)酵母菌。5.8S-ITS區(qū)的4種內(nèi)切酶(HaeⅢ、Hin6Ⅰ、HinfⅠ、AluⅠ)的酶切分析產(chǎn)出4種特異性圖譜。根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析和BLAST比對(duì)，將供試菌株鑒定為4個(gè)屬4個(gè)種，分別為Saccharomyces cerevisiae、Candida zemplinina、Hanseniaspora uvarum、Pichia kluyveri var. kluyveri；而根據(jù)5.8S-ITS-RFLP及5.8S-ITS序列分析，將供試菌種鑒定為Saccharomyces cerevisiae、Candida zemplinina、Hanseniaspora uvarum、Issatchenkia terricola 4個(gè)屬4個(gè)種。3種方法對(duì)供試的10個(gè)菌株的鑒定結(jié)果一致，而對(duì)另外3株的鑒定結(jié)果不同。

葡萄酒相關(guān)酵母；分子系統(tǒng)學(xué)；鑒定；5.8S-ITS-RFLP；26S rDNA D1/D2序列分析；5.8S-ITS序列分析

傳統(tǒng)的酵母菌株鑒定方法建立在菌株的形態(tài)、生理特性和生物化學(xué)特性質(zhì)差異之上。然而這些特征會(huì)受培養(yǎng)條件的影響，在某種程度上具有不確定性，為確保鑒定結(jié)果的可靠性，鑒定一株菌經(jīng)常需要完成50～100項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[1]。盡管酵母菌的培養(yǎng)及菌落的觀察極其簡(jiǎn)單，但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力且重復(fù)性差的弊端卻不可避免。與之相比，分子鑒定以其所提供的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確與多種選擇性的方法成為一種重要的鑒定手段。近年來(lái)，新的鑒定方法主要建立在核酸序列上。26S、18S、5.8S、5S核糖體是較為保守的片段，其所帶的信息是菌種鑒定的依據(jù)。其中，ITS-5.8S(內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū))位于小亞基和大亞基rRNA基因之間，該區(qū)可分為ITS1區(qū)和ITS2區(qū)。5.8S-ITS的限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的片段大小和數(shù)目存在多態(tài)性，對(duì)于每一個(gè)種ITS-5.8S rDNA的限制性內(nèi)切酶組合來(lái)說(shuō)，所產(chǎn)生的片段是特異性的，作為該種菌ITS-5.8S rDNA所特有的“指紋”(即片段差異的多態(tài)性)，可依此進(jìn)行種的水平上的歸類[2]。26S rDNA在對(duì)大量未知菌種的快速鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析中顯示了很大的優(yōu)勢(shì)[3]。Kurtzman等[4]在對(duì)將近500株子囊酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)的測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析中發(fā)現(xiàn)同一種內(nèi)不同菌株間D1/D2區(qū)的核苷酸差異不超過(guò)1%。依此為依據(jù)，通過(guò)26S rDNA D1/D2區(qū)測(cè)序并進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，可方便地將酵母菌鑒定到種。

本研究通過(guò)最常用的3種分子系統(tǒng)學(xué)方法，即5.8SITS-RFLP分析、26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析、5.8S-ITS區(qū)序列分析及GenBank查詢和BLAST比對(duì)，對(duì)分離自新疆鄯善葡萄產(chǎn)區(qū)的酵母菌進(jìn)行分類鑒定，同時(shí)比較幾種分子系統(tǒng)學(xué)方法在鑒定結(jié)果上的異同。

1 材料與方法

1.1 材料

自新疆鄯善葡萄酒產(chǎn)區(qū)，從自然發(fā)酵葡萄醪分離獲得酵母菌。在形態(tài)和生理生化鑒定基礎(chǔ)上，選取13株代表性類型進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

從新疆鄯善葡萄自然發(fā)酵醪中分離獲得酵母菌株，菌株分離使用YPD培養(yǎng)基(10g/L酵母浸粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、20g/L瓊脂，自然pH值)。

1.2.2 酵母DNA提取

采用石英砂破壁法[5]。

1.2.3 5.8S-ITS區(qū)和26S rDNA D1/D2基因序列的PCR擴(kuò)增

按Guillamon等[6]的反應(yīng)程序、使用引物ITS1 (5′-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4 (5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3＇)[7]進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果查詢GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用BLAST在線工具進(jìn)行序列相似性比較。

利用引物NL1和NL4擴(kuò)增菌株的26S rDNA D1/D2基因序列[6]，將測(cè)序產(chǎn)物送交生工生物(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序生物結(jié)果查詢GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用BLAST在線工具進(jìn)行序列相似性比較。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶消化

純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ、Hin6Ⅰ和AluⅠ(MBI產(chǎn)品)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)消化；30g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 5.8S-ITS-RFLP分析

由引物ITS1和ITS4擴(kuò)增的核糖體rRNA的重復(fù)單元包括兩個(gè)非編碼的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS1和ITS2及5.8S rRNA基因。PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度多樣性也顯示了種屬間的差異[8]。在所鑒定的菌株中釀酒酵母的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為820～880bp，葡萄汁有孢漢遜酵母為760～800bp，伊薩酵母為400～480bp，畢赤酵母為420bp，假絲酵母為400～420bp。

5.8 S-ITS的 PCR產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶消化所得的電泳圖譜如圖1所示。一般同種酵母具有相同的酶切位點(diǎn)數(shù)目，所得的酶切片段數(shù)目和大小相同[9]。通過(guò)酶切圖譜分析，被測(cè)菌株可分別歸為4個(gè)不同類型:Ⅰ類包括A24-3-1、A27-3-2、A24-2-2、A27-3-5；Ⅱ類包括A9-5-3、A5-5-5、A9-4-7、A13-1-3；Ⅲ類包括A6-1-6、A27-3-4、A27-4-1；Ⅳ類包括A9-3-2、A11-1-1。

圖1 鄯善地區(qū)菌株4種限制性內(nèi)切酶消化的凝膠電泳圖Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of PCR amplified 5.8S-ITS region from 13 yeast strains

PCR產(chǎn)物由4種限制性內(nèi)切酶消化(HaeⅢ、HinfⅠ、Hin6Ⅰ和AluⅠ)消化片段見(jiàn)表1(100bp以下不可視片段未記錄)。與已知文獻(xiàn)[2,6,9]及5.8S-ITS-RFLP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// yeast-id.com/)比對(duì)得出:菌株A24-3-1、A27-3-2、A24-2-2和A27-3-5可鑒定為Saccharomyces cerevisia，菌株A9-5-3、A5-5-5、A9-4-7和A13-1-3可鑒定為Candida zemplinina；菌株A6-1-6、A27-3-4和A27-4-1可鑒定為Hanseniaspora uvarum；菌株A9-3-2和A11-1-1可鑒定為Issatchenkia terricola。

表1 鄯善地區(qū)菌株限制性酶切片段長(zhǎng)度Table 1 Lengths (in bp) of the 5.8S-ITS region of yeast strains from Shanshan amplified by PCR and the fragments obtained after digestion with four restriction endonucleases

表2 被測(cè)序菌株26S rDNA D1/D2片斷大小及與相關(guān)菌株的序列相似性Table 2 26S rDNA D1/D2 fragment size of the sequenced strains and the identity with related yeasts

2.2 26S rDNA D1/D2區(qū)的測(cè)序及分析

根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)的序列測(cè)定和GenBank查詢及BLAST比對(duì)，將供試菌株鑒定到種的水平，包括3株Candida zemplinina、5株Hanseniaspora uvarum、4株Saccharomyces cerevisia、1株P(guān)ichia kluyveri var. kluyveri(表2)。

比較表1、2的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)5.8S-ITS-RFLP的鑒定結(jié)果與26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析的結(jié)果存在一些差異:它們對(duì)供試的10株菌的鑒定結(jié)果一致，而對(duì)另外3株的鑒定結(jié)果不同(表3)。其中，對(duì)于菌株A9-4-7，前者的鑒定結(jié)果為H.uvarum，而后者將其鑒定為C.zemplinina；對(duì)于菌株A11-1-1和A9-3-2，前者的鑒定結(jié)果均為I. terricola，后者將其分別鑒定為P.kluyveri var. kluyveri和H.uvarum。

對(duì)鑒定結(jié)果存在分歧的3個(gè)菌株A9-4-7、A11-1-1和A9-3-2，繼續(xù)進(jìn)行5.8S-ITS測(cè)序和BLAST比對(duì)，結(jié)果均同5.8S-ITS-RFLP分析的鑒定結(jié)果相一致(表4)，而與26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果不同。

由于菌株A9-4-7的5.8S-ITS的PCR產(chǎn)物為410bp，而H.uvarum的為800bp，因而不能接受26S rDNA D1/D2區(qū)的測(cè)序和鑒定結(jié)果；根據(jù)5.8S-ITS區(qū)的測(cè)序和序列比對(duì)結(jié)果，A9-4-7可確認(rèn)為C. zemplinina。而菌株A11-1-1和A9-3-2的分類歸屬，尚需進(jìn)一步鑒定。

表4 新疆鄯善地區(qū)酵母菌株5.8S-ITS測(cè)序結(jié)果Table 4 5.8S-ITS fragment size of the sequenced strains and their identity with related yeasts

表3 3種分子系統(tǒng)學(xué)鑒定方法的結(jié)果比較Table 3 Comparison of identification results by the three different methods

3 討 論

5.8 S-ITS- RFLP分析是一種無(wú)需進(jìn)行測(cè)序就可獲得較為精確的鑒定結(jié)果的分析方法，而且簡(jiǎn)單易行，目前多用于菌種種間的區(qū)分。Montrocher等[8]利用rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析和ITS序列分析方法研究了屬于狹義釀酒酵母組(S.cerevisiae、S.bayanus、S.paradoxus、S.pastorianus)的菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，兩種分析方法顯示了非常相似的結(jié)果。兩種方法都將這些菌株區(qū)分為較為明顯的兩大系統(tǒng)發(fā)育類群，即S.cerevisiae群和S.bayanus群，證實(shí)了S.cerevisiae和S.bayanus是兩個(gè)定義明確的分類群。然而，另外兩個(gè)現(xiàn)今被普遍接受的歸入狹義釀酒酵母組的S.paradoxus和S.pastorianu，不能明顯地與S.cerevisiae和S.bayanus區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且，無(wú)論是對(duì)于PCR-RFLP還是在ITS序列分析中S.paradoxus在狹義釀酒酵母組中處于最外層的位置。

de Llanos Frutos等[10]利用此技術(shù)結(jié)合序列分析對(duì)假絲酵母屬進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，并且建立了包含有假絲酵母屬的75個(gè)種共109株酵母菌的數(shù)據(jù)庫(kù)。Fernadez-Espinar等[2]對(duì)酵母屬菌種進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明這是一種可進(jìn)行菌種鑒定快捷而準(zhǔn)確的方法。las Heras-Vazquez等[11]利用此技術(shù)結(jié)合序列分析對(duì)從橘子及其果汁自然發(fā)酵過(guò)程中分離到的酵母菌初步進(jìn)行鑒定，鑒定出了Candida tropicalis、Clavispora lusitaniae、Hanseniaspora uvarum、Pichia anomala、Pichia fermentans、Rhodotorula mucilaginosa、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces unisporus和Trichosporon asahii等酵母，結(jié)和形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特性分析表明該方法可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行酵母菌的鑒定。

限制性內(nèi)切酶的選擇很關(guān)鍵，選用不同的內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的酶切圖譜。Naumova等[12]指出Hae Ⅲ對(duì)于區(qū)分酵母屬間酵母具有很好的效果，他們?cè)趯?duì)Saccharomyces屬的基因差異研究中指出Hae Ⅲ可以很好的將S. cerevisiae從S. paradoxus和S. bayanus中區(qū)分出來(lái)。Fernadez-Espinar等[2]使用了9種酶對(duì)酵母屬(Sacch aromyces)的酵母進(jìn)行了5.8S-ITS區(qū)的RFLP分析，也指出HaeⅢ對(duì)于區(qū)分酵母屬間酵母具有很好的效果，對(duì)S.cerevisiae、S.paradoxus、S.pastorianus、S. castelli、S.dairenensis、S.exiguus、S.kunashirensis、S.martiniae、S.rosinii、S.servazzii等都可產(chǎn)生不同的限制型酶切片段。但無(wú)法區(qū)分S.bayanus與S.paradoxus。

HinfⅠ、Hin6Ⅰ在假絲酵母的分類中有廣泛的應(yīng)用，但de Llanos Frutos等[10]在研究中指出，5.8S rDNA的RFLP不能區(qū)分假絲酵菌的有性態(tài)和無(wú)性態(tài)。在德克酵母屬中，5.8S rDNA的RFLP分析不能很好的區(qū)分該屬酵母，因?yàn)樵趥€(gè)別種的序列上僅有一個(gè)堿基的差異。

Hin6Ⅰ與HinfⅠ在葡萄酒相關(guān)酵母的RFLP分析鑒定中具有比較顯著的多態(tài)性，這在本研究中得到證實(shí)，但HaeⅢ不能有效區(qū)分供試的非酵母屬酵母，這在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)；AluⅠ的多態(tài)性也較差，不能用來(lái)區(qū)分所有實(shí)驗(yàn)菌株。

雖然通過(guò)對(duì)酶切片段大小的估計(jì)和文獻(xiàn)查詢及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)(5.8S-ITS-RFLP數(shù)據(jù)庫(kù)http://yeast-id.com/)，可以將供試酵母菌快速鑒定到種。但5.8S-ITS-RFLP數(shù)據(jù)庫(kù)還未涵蓋酵母的所有種，實(shí)際工作中對(duì)酶切片段大小的估計(jì)也往往存在誤差，使得近緣種的區(qū)分不易進(jìn)行。

相比之下，隨著DNA序列分析技術(shù)的日趨成熟和簡(jiǎn)易化，序列分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酵母菌的分類鑒定以及系統(tǒng)學(xué)研究。其中，rRNA基因(rDNA)及其轉(zhuǎn)錄間區(qū)(ITS)的序列是最為常用的，包括18S rDNA、26S rDNA的D1/D2、ITS、5.8S rDNA。這些序列均己經(jīng)公布于GenBank/EMBL/DDBJ等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為酵母菌的分類鑒定帶來(lái)了極大的便利。

酵母菌小亞基rRNA存在不同保守程度序列的鑲嵌現(xiàn)象(從高度保守到半保守區(qū)到高可變區(qū))，使得該分子可以用來(lái)衡量較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，也適宜于較近的親緣關(guān)系。這個(gè)區(qū)域大約有1800bp，含有不同變異率的區(qū)段，可以用于種、屬或更高等級(jí)分類群之間的系統(tǒng)關(guān)系研究。James等[13]根據(jù)18S rDNA基因序列，對(duì)Saccharomyces屬及相關(guān)的子囊菌酵母(包括Kluyveromyces、Torulaspora、Zygosaccharomyces)進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)果顯示在分子系統(tǒng)樹(shù)上狹義釀酒酵母組內(nèi)的4個(gè)種形成一個(gè)獨(dú)立的分支，表明其非常近緣的系統(tǒng)演化關(guān)系，但該屬內(nèi)的其他種卻分散在不同的分支之中，并與Kluyveromyces、Torulaspora、Zygosaccharomyces屬的某些種聚合在一起，分子系統(tǒng)學(xué)研究表明，以形態(tài)和生理生化特性界定的Saccharomyces屬及相關(guān)的子囊菌酵母屬均是異源性的非自然屬，應(yīng)作進(jìn)一步的調(diào)整。

ITS(internal transcribed spacer)區(qū)為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于18S rDNA和26S rDNA之間，包括ITS1和ITS2兩個(gè)片斷，中間包含一個(gè)5.8S rDNA片段。通常，在分析ITS區(qū)域序列時(shí)也將5.8S rDNA一起進(jìn)行考慮，但5.8S rDNA相對(duì)保守，從中獲取的信息量很少[14]。ITS區(qū)域與rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)相比具有較高的變異率，對(duì)于親緣關(guān)系較近的菌株間的區(qū)分是比較有效的[8]。Takashima[15]、Sugita[16-17]等研究表明ITS區(qū)域的差異大于1%時(shí)就可能代表不同的種，然而對(duì)于不同的屬而言，情況會(huì)有所不同。

ITS區(qū)序列常常與其他序列相結(jié)合，應(yīng)用于酵母菌分類的系統(tǒng)學(xué)研究中。Sipiczki[18]利用ITS和大亞基序列分析，對(duì)一株貴腐酒中的耐寒耐滲透性菌C. zemplinina進(jìn)行了鑒定，結(jié)果分別顯示了8% 和 8.1%的差異率，分析認(rèn)為這是一種新種Candida zemplinina sp. nov.。

26S rDNA的Dl/D2區(qū)域位于大亞基的5＇端，序列長(zhǎng)度在600bp左右，該段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究。Peterson等[3]研究了核糖體大亞基5＇端可變區(qū)D1/D2區(qū)域的序列，他們的工作顯示同一菌種在 Dl/D2區(qū)域一般有少于1%的替代率，而不同種的菌株有比這個(gè)數(shù)字更大的值，因此為菌株的鑒定提供了一個(gè)經(jīng)驗(yàn)性方法。Kurtzman等[4]利用D1/D2序列分析全面評(píng)價(jià)了囊括整個(gè)子囊菌酵母的500多種酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，數(shù)據(jù)顯示用該區(qū)域的序列足以確定大部分菌種的發(fā)育地位，其結(jié)果預(yù)測(cè)了55個(gè)當(dāng)今被確認(rèn)的分類群是早期描述的菌種的異名。他們認(rèn)為酵母菌同一個(gè)種的不同菌株其堿基差異一般不超過(guò)1%，而屬于不同種的菌株其核甘酸序列差異一般較大，根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，可以將絕大部分種區(qū)分開(kāi)。Fell等[19]根據(jù)Dl/D2區(qū)域?qū)?dān)子菌酵母做了系統(tǒng)學(xué)研究，它們的研究結(jié)果也得出了相似的結(jié)果。目前，一般認(rèn)為Dl/D2區(qū)堿基差異在1%以上就代表了不同的種，盡管區(qū)分緊密相關(guān)的種時(shí)需要運(yùn)用ITS區(qū)，但大多數(shù)種都可以用D1/D2區(qū)序列分析進(jìn)行區(qū)別。

van Keulen等[20]根據(jù)26S rDNA的D1/D2區(qū)序列及酶切分析研究了Lake Erie地區(qū)霞多麗、雷司令、灰比諾自然發(fā)酵過(guò)程中分離的酵母菌，研究發(fā)現(xiàn)該方法可以在屬的水平上對(duì)酵母菌進(jìn)行很好地區(qū)分，成功的鑒定出了Torulaspora delbrueckii、S. bayanus，并獲得了與H.uvarum、P.kluyveri、C.stellata、S.cerevisiae相關(guān)的菌種。

目前，所有已描述的酵母菌種的大亞基rDNA D1/D2區(qū)序列都可以在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)上查詢到，因此，D1/D2區(qū)序列通常用于種的水平上的鑒定。總的來(lái)說(shuō)，大亞基D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)表型分析結(jié)果相一致，但有時(shí)具有相同D1/D2區(qū)序列的菌株，雜交遺傳學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)特征卻表明它們不屬于同一個(gè)種。

其中，26S rDNA的D1/D2區(qū)序列已建成了完備的分析數(shù)據(jù)庫(kù)，用其進(jìn)行酵母菌種的鑒定更為方便準(zhǔn)確，其應(yīng)用也最為廣泛[19,21]。雖然26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析，可以有效的將一些未知菌株鑒定到種，但是對(duì)于一些特殊菌種也存在一定的不足，需要輔以其他的鑒定方法，比如18S rDNA測(cè)序[13]、ITS區(qū)測(cè)序或者5.8S rDNA限制性酶切分析等[9]，甚至要做一些復(fù)雜的生理生化檢測(cè)才能鑒定到種。Scorzetti等[21]研究表明，C.magnus、F. magnus和F. floriforme 的26S rRNA D1/D2區(qū)基因序列是完全相同的，只通過(guò)這段基因序列分析無(wú)法區(qū)分這3個(gè)種，但是在5.8S-ITS區(qū)序列存在很大的差異，通過(guò)5.8S-ITS區(qū)序列分析可以被很好的區(qū)別。

本研究通過(guò)最常用的3種分子系統(tǒng)學(xué)方法，即5.8SITS的RFLP分析、26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析、5.8SITS區(qū)序列分析及GenBank查詢和BLAST比對(duì)，對(duì)分離自新疆鄯善葡萄產(chǎn)區(qū)的13株酵母菌進(jìn)行了分類鑒定，同時(shí)比較了它們?cè)阼b定結(jié)果上的異同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5.8S-ITSRFLP的結(jié)果與5.8S-ITS序列分析的鑒定結(jié)果相符合；而5.8S-ITS-RFLP及5.8S-ITS分析與26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果存在一些差異，3種方法對(duì)供試的10個(gè)菌株的鑒定結(jié)果一致，而對(duì)另外3株的鑒定結(jié)果不同。對(duì)于菌株A9-4-7的鑒定，否定了26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析認(rèn)為其為H.uvarum的結(jié)果，因?yàn)樵摼?.8SITS區(qū)PCR產(chǎn)物的大小與H.uvarum的相差太大；而綜合5.8S-ITS區(qū)PCR產(chǎn)物的大小及5.8S-ITS-RFLP分析和5.8S-ITS序列分析，將菌株A9-4-7鑒定為C.zemplinina，這也在經(jīng)典分類鑒定的結(jié)果中得到了證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。

對(duì)于菌株A11-1-1和A9-3-2，鑒于幾種分類鑒定結(jié)果的分歧，它們的分類地位尚不能確定，還需佐以經(jīng)典分類方法和/或其他的分子生物學(xué)方法進(jìn)行確認(rèn)。

本研究對(duì)酵母菌鑒定中最常用的3種分子系統(tǒng)學(xué)方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較得出:對(duì)酵母菌的鑒定，不能過(guò)分依賴于分子系統(tǒng)學(xué)的結(jié)果；如果三者的鑒定結(jié)果能相互印證，則可以確認(rèn)鑒定的結(jié)果，而如果相互之間的結(jié)果不相符合，則需根據(jù)具體的情況確認(rèn)，必要時(shí)再佐以經(jīng)典分類方法和/或其他的分子生物學(xué)方法。

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Molecular Phylogenic Identification of Wine-Related Yeasts

WANG Ze-ju，WANG Ru-zhen，SUN Yue，YANG Ying，LIU Yan-lin*(College of Enology, Northwest A&F University, Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

In this study, thirteen wine-related wild yeast strains from Shanshan, Xijiang were identified by PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) and sequence analysis of the 5.8S-ITS region and the 26S rDNA D1/D2 domains. The PCR amplified 5.8S-ITS region were digested with four restriction endonucleases, Hae Ⅲ, Hin6Ⅰ, HinfⅠand AluⅠ to obtain 4 specific patterns. According to the sequence analysis of the 26S rDNA D1/D2 domains and BLAST alignment, the 13 yeast strains were identified as Saccharomyces cerevisiae, Candida zemplinina, Hanseniaspora uvarum and Pichia kluyveri var. kluyveri, while they were identified as Saccharomyces cerevisiae, Candida zemplinina, Hanseniaspora uvarum and Issatchenkia terricola according to the PCR-RFLP and sequence analysis of the 5.8S-ITS region. The same identification results for 10 of the 13 isolated yeast strains were obtained using the three methods, whereas inconsistent identification results were obtained for other three.

wine-related yeasts；molecular phylogeny；identification；5.8S-ITS-RFLP；26S rDNA D1/D2 sequence；5.8S-ITS sequence

Q93-331

A

1002-6630(2012)15-0195-06

2011-07-01

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(葡萄)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-30-jg-3)

王澤舉(1981—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸莆⑸铩-mail:zejuwang@163.com

*通信作者:劉延琳(1966—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸?葡萄酒工程及釀酒微生物。E-mail:yanlinliu@nwsuaf.edu.cn