毛霉發酵法制備豆渣可溶性膳食纖維的研究

潘進權，伍惠敏，陳雨鈿

毛霉發酵法制備豆渣可溶性膳食纖維的研究

潘進權，伍惠敏，陳雨鈿

(湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048)

以豆渣為原料，采用毛霉發酵方法制備可溶性膳食纖維。采用單因素試驗、部分析因設計、中心組合設計及響應面分析的方法對影響豆渣可溶性膳食纖維制備工藝的因素:培養基含水量、起始pH值、發酵溫度、發酵時間等發酵工藝進行分析，并對其進行優化，確定相對較合適的發酵工藝條件:每支250mL三角瓶裝干豆渣10g，加水調節其含水量為56.7%，添加蛋白胨2.33%、KH2PO4 0.57%、CaCl2 0.2%、吐溫-80 0.2%，調節培養基起始pH6.0，接種后置于25℃發酵80h。在優化的工藝條件下，豆渣可溶性膳食纖維的得率可達42.2%。結果表明，毛霉發酵可以顯著提高豆渣中可溶性膳食纖維的含量，應用該方法制備豆渣可溶性膳食纖維具有可行性。

可溶性膳食纖維；豆渣；毛霉；發酵；制備

廣義上的膳食纖維泛指不能被人體內源酶消化吸收的可食用植物細胞、多糖、木質素以及相關物質的總和，包括食品中的大量組成成分如纖維素、半纖維素、木質素、膠質、改性纖維素、黏質、寡糖、果膠以及少量組成成分如蠟質、軟木質。按其溶解特性不同分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)兩大類，兩者在人體內所具有的生理功能有所不同[1-3]。相比而言，可溶性膳食纖維對人體的生理代謝發揮著更為重要的作用，它具有防止膽結石、排除體內有害金屬離子、防治糖尿病、降低血清及膽固醇、防止高血壓和心臟病等作用[4-6]；是一種極具應用開發潛力的功能食品添加劑。

豆渣是大豆產品如豆奶或豆腐加工過程中的副產品，中國、阿根廷、巴西、美國、日本等國家每年豆渣的產量很大。因此豆渣的綜合利用已成為各國科研工作者關注的重要問題之一。然而目前豆渣的利用率卻很低，生產上主要是將豆渣作為動物飼料、焚燒或是直接廢棄。這樣不但造成了資源浪費也導致了環境污染。

研究顯示，豆渣富含膳食纖維，其含量可高達60%以上，其中的大豆可溶性膳食纖維更是一種具有潛在應用價值的生理活性物質，具有明顯降低血清膽固醇，改善血糖生成反應，改善大腸功能等作用，對機體健康有重要的生理功能[7]。因此，豆渣是制備可溶性膳食纖維的優良原料。雖然豆渣總膳食纖維含量較高，但是其中的可溶性膳食纖維的含量卻非常低(小于5%)。因此，如何提高豆渣中可溶性膳食纖維的含量成為研究的關鍵。

毛霉是傳統豆類發酵食品的常用菌種，它具有分泌多種水解酶，如蛋白酶、糖苷酶、纖維素酶、脂肪酶等的能力，可以實現豆渣中多種大分子物質的水解與轉化[8-9]。為此，本研究擬以毛霉發酵的方法來轉化豆渣，以提高豆渣中可溶性膳食纖維含量為目標對發酵工藝進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮干豆渣(含水量9.7%) 市售。

1.2 菌種與培養基

毛霉(Mucor sp.)，為湛江師范學院生命科學與技術學院發酵工程實驗室分離保藏菌種。

試管斜面培養基:采用PDA培養基；菌種活化培養基:每支250mL三角瓶中加入干麩皮10g，水10mL，攪拌均勻，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

豆渣基礎發酵培養基:每支250mL三角瓶中裝入干豆渣10g，加入15mL水，攪拌均勻滅菌后備用。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

從試管斜面培養基上挑取一環毛霉孢子轉接到菌種活化培養基上，混勻后置于恒溫箱內，28℃培養3d。

1.3.2 孢子懸液制備

向活化后的三角瓶麩曲中加入無菌水100mL，充分搖勻，用4層無菌紗布過濾，其濾液即為毛霉孢子懸液(孢子濃度為107個/mL)，用作接種豆渣發酵用。

1.3.3 豆渣發酵實驗

每支滅菌后的三角瓶發酵培養基中接入1mL孢子懸浮液，旋轉搖勻，置于生化培養箱中28℃培養3d。

1.3.4 豆渣中可溶性膳食纖維的提取

在預實驗[10-11]結果基礎上，確定了發酵豆渣中可溶性膳食纖維的提取方法:豆渣發酵結束后，向每支三角瓶中加入蒸餾水300mL(相對于培養基原干豆渣，固液比1:30)，調pH值到4.0，在80℃恒溫水浴鍋中加熱120min，抽濾得到濾液。加入4倍濾液體積的無水乙醇，靜置30min，抽濾，并多次用80%乙醇洗滌濾渣。將濾渣置于烘箱中105℃烘干至恒質量并稱質量。

1.3.5 SDF得率的計算

式中:m為發酵豆渣提取得到的SDF質量/g；m1為發酵培養基中原干豆渣的質量/g。

1.3.6 單因素試驗

分別考察基礎發酵培養基中各種營養添加物、含水量、起始pH值、發酵溫度與時間對毛霉發酵及水溶性膳食纖維轉化率的影響。

1.3.7 部分析因設計

通過上述單因素試驗初步確定對毛霉發酵有促進作用的若干影響因素，并確定各因素的適宜取值范圍。為了進一步考察這些因素的影響程度及各自合適的取值，利用Minitab軟件，采用其中的Plackett-Burman設計，對上述單因素試驗篩選到的因素做進一步的分析，并由此篩選出對毛霉發酵有顯著促進作用的因素。

1.3.8 中心組合試驗設計

利用SAS統計軟件，采用響應面分析法中的中心組合設計[12]，對部分析因設計中篩選的因素做進一步考察，以確定其最合適的取值，并由此確定發酵工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 營養添加物對毛霉發酵的影響

分別在豆渣基礎發酵培養基中以干豆渣為基準添加質量分數3%的碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉)、2%的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4)、0.3%無機鹽(MgCl2、CaCl2、ZnSO4、FeSO4、MnSO4、CuSO4)、0.5%無機鹽(KH2PO4、K2HPO4)及0.2% 吐溫-80，其他成分保持不變，進行固體發酵，從而篩選對毛霉發酵有促進作用的營養因素，結果如表1所示。可以看出，原基礎發酵培養基中的碳源(殘留于豆渣中的碳水化合物)已足以滿足毛霉生長及代謝的需求，額外添加碳源對毛霉發酵并無顯著促進作用，相反一些小分子碳源添加物對毛霉發酵表現出了顯著抑制作用，降低了SDF的得率。這可能是由于這些小分子碳源的添加抑制了毛霉纖維素酶的誘導表達[13]；不同類型的氮源添加物對毛霉發酵的作用有明顯差異，其中無機氮源對毛霉發酵幾乎沒有什么作用，而有機氮源尤其是蛋白胨可以顯著促進毛霉發酵，提高SDF得率；在試驗的幾種無機鹽中，僅有CaCl2與KH2PO4對毛霉發酵有較顯著的促進作用；此外，培養基中添加一定量的吐溫-80也對毛霉發酵及SDF得率有明顯的促進作用。根據以上實驗結果初步確定對毛霉發酵及S D F得率有促進作用的幾種營養物:蛋白胨、CaCl2、KH2PO4及吐溫－80。

2.1.2 培養基含水量對毛霉發酵的影響

對于固體發酵來說，培養基的含水量尤為重要，因為它直接關系著培養基中營養物質的溶解及運輸，同時也與培養基中氧氣的供應密切相關。培養基含水量過低，則營養物質及氧氣的溶解及運輸受到限制；過高的含水量又會導致培養基中空氣流通受影響，從而使氧氣的供給受到限制[14-15]。為了確定發酵培養基的合適含水量，采用原發酵培養基分別于不同含水量(35%～80%)的條件進行固體發酵實驗，考察培養基含水量對毛霉發酵的影響，結果如圖1所示。培養基含水量對毛霉發酵有顯著的影響，當培養基的含水量低于50%或是高于75%時，豆渣SDF得率明顯偏低。故確定發酵培養基合適的含水量在50%～70%的范圍。

圖1 培養基含水量對毛霉發酵的影響Fig.1 Effect of water content in the medium on SDF yield

表1 各種營養添加物對毛霉發酵的影響Table 1 Effects of nutrient supplements on SDF yield

2.1.3 培養基起始pH值對毛霉發酵的影響

圖2 pH值對毛霉發酵的影響Fig.2 Effect of pH on SDF yield

在總含水量不變的前提下，分別用酸或堿調節原基礎發酵培養基的起始pH值至4.0～9.0的范圍，然后進行發酵試驗，考察培養基起始pH值對毛霉發酵的影響。由圖2可知，pH值對毛霉發酵及豆渣中膳食纖維轉化有較顯著的影響，培養基的酸性或堿性太強均不利于菌體生長及膳食纖維的轉化；相比而言，弱酸性的條件更有利于該菌種發酵。確定發酵培養基適宜的起始pH值在5～7的范圍。

2.1.4 發酵溫度對毛霉發酵的影響

采用基礎培養基分別于不同溫度(18、22、25、28、31、35、38℃)條件下進行發酵實驗，考察溫度對毛霉發酵的影響，結果如圖3所示。毛霉菌是一種適低溫菌，相對較低的溫度(低于28℃)有利于該菌體生長及膳食纖維的轉化，過高的溫度對毛霉發酵不利。如，當發酵溫度高于31℃時，毛霉的生長及膳食纖維的轉化將受到顯著的抑制。根據實驗結果初步確定該菌種合適的發酵溫度在22～28℃范圍。

圖3 溫度對毛霉發酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on SDF yield

2.1.5 發酵時間對毛霉發酵的影響

圖4 發酵時間與SDF得率的關系Fig.4 Effect of fermentation time on SDF yield

采用原基礎發酵培養基進行固體發酵實驗，分別于不同時間取樣測定SDF得率，考察發酵時間對毛霉發酵的影響，結果如圖4所示。在發酵的前期(24h內)，由于孢子剛剛萌發，菌絲初步形成，菌體量少，酶活力低，因此膳食纖維的轉化速率非常低；發酵30h后，菌體進入快速生長及產酶旺期，膳食纖維的轉化基本上以恒速進行；發酵到72h后，由于培養基水分的大量蒸發、營養物質的消耗以及培養基pH值的變化等在很大程度上抑制了菌體的生長，膳食纖維的轉化速度趨于平緩，SDF得率逐漸達到最大。初步確定毛霉發酵的合適時間為70～90h。

2.2 部分析因設計

通過以上單因素試驗篩選得到對毛霉發酵有促進作用的8個因素。為了進一步分析這些因素對毛霉發酵影響的顯著性，采用部分析因設計的方法對其進行了進一步考察，表2～4分別給出了試驗設計的因素水平設計、結果及其回歸分析。

表2 部分析因設計的因素水平表Table 2 Factors and levels of fractional factorial design

表3 部分析因試驗設計及結果Table 3 Fractional factorial design scheme and corresponding experimental results

由表4可知，在表2設定的各因素取值范圍內，因素A、C、E、F對毛霉發酵表現為正效應，即對毛霉發酵與SDF得率有促進作用；因素B、D、G、H在取值范圍內對毛霉發酵表現出負效應；在考察的8個因素中，蛋白胨(A)、KH2PO4(C)、培養基含水量(G)對毛霉發酵的影響極為顯著(P＜0.01)；CaCl2(B)、吐溫-80(D)及發酵溫度(E)對毛霉發酵的影響較顯著(P＜0.05)；發酵時間(F)與培養基起始pH值(H)對毛霉發酵的影響不顯著(P＞0.05)。另外，本試驗結果的曲率分析則表明，部分析因設計確定的實驗空間是一極顯著的曲面(P＜0.01)，其中必然存在最大或最小響應點。為了確定此實驗空間內的極值響應點，后續實驗將以因素A、C、G為對象，在表1所示的各因素取值范圍內進行中心組合試驗設計及響應曲面分析。在此同時固定因素B、D、E和F的取值為中水平。

表4 部分析因試驗結果的回歸分析Table 4 Regression analysis of the experimental results of fractional factorial design

2.3 中心組合試驗設計結果

在以上部分析因試驗結果的基礎上進行了中心組合試驗設計，考察了蛋白胨(A)、KH2PO4(C)和培養基含水量(G)三者的相互作用及其對毛霉發酵的影響。中心組合試驗設計及結果如表5所示。

表5 中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design scheme and corresponding experimental results

對表5的試驗結果進行回歸分析，可以擬合得到以下數學模型:

分析表明，該回歸模型具有非常高的顯著性，其P＝0.000＜0.01，R2＝0.9250，說明該模型可以擬合實驗空間中92.5%的實驗結果。圖5～7給出了擬合模型的響應曲面。可以看出，該曲面是一典型的凸面響應，其上存在最大響應點。利用SAS軟件分析確定了最大響應值為(42.3±0.6)%，其對應的因素取值分別為蛋白胨2.33%、KH2PO40.57%、培養基含水量56.7%。在此條件下，測得SDF得率平均值為42.2%，與模型的預測值基本一致，進一步驗證了該模型的可靠性。

圖5 蛋白胨與KH2PO4對毛霉發酵的影響Fig.5 Response surface plot showing the effects of peptone and KH2PO4 on SDF yield

圖6 KH2PO4與培養基含水量對毛霉發酵的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of KH2PO4 and water content in the medium on SDF yield

圖7 蛋白胨與培養基含水量對毛霉發酵的影響Fig.7 Response surface plot showing the effects of petone and water content in the medium on SDF yield

根據以上優化實驗的結果，由此可確定毛霉發酵制備可溶性膳食纖維的工藝條件為:每支250mL三角瓶裝豆渣10g，加水調節其含水量為56.7%，添加蛋白胨2.33%、KH2PO40.57%、CaCl20.2%、吐溫-80 0.2%，調節培養基起始pH值為6.0，滅菌后接種1mL孢子懸浮液，置于25℃發酵80h。

3 討 論

豆渣是大豆制品加工后的廢棄物，開展其應用相關研究對于提高資源利用率，改善豆渣廢棄導致的環境問題有重要意義。以豆渣為原料提取制備可溶性膳食纖維是該領域的研究熱點。在眾多以往的研究報道中，豆渣膳食纖維的轉化采用較多的是物理方法，如蒸煮、擠壓或輔助超聲波作用[16-17]，雖然這些方法對豆渣中可溶性膳食纖維含量的提高有一定的作用，但由于工藝復雜、生產成本較高而不具有推廣價值。近年來也有采用酶解的方法制備豆渣膳食纖維的報道[18-19]，雖然生產工藝較溫和，能耗也較低，但由于單一酶解的效率并不高，因此豆渣可溶性膳食纖維的轉化率也是比較低的。

為了克服酶解法的不足，本研究提出了以毛霉發酵的方法轉化豆渣制備可溶性膳食纖維，利用毛霉發酵過程中分泌的復合酶系水解豆渣中大分子物質，從而極大程度上提高豆渣可溶性膳食纖維的得率。該研究采用單因素試驗、部分析因設計及響應面分析的方法對影響毛霉發酵的若干因素進行了分析，并對發酵工藝進行優化，確定了合適的發酵工藝條件。在優化的條件下，豆渣可溶性膳食纖維的得率可以達到42.2%，高于現有文獻報道結果[16-20]。結果表明:毛霉發酵可以顯著增加豆渣中可溶性膳食纖維的含量，提高可溶性膳食纖維的得率；應用該工藝制備豆渣可溶性膳食纖維具有較好的可行性。

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Preparation of Soluble Dietary Fiber from Soybean Dregs by Mucor Fermentation

PAN Jin-quan，WU Hui-min，CHEN Yu-tian
(School of Life Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China)

Soybean dregs were used as the basal fermentation medium for Mucor to produce soluble dietary fiber (SDF). The effects of major parameters including water content in medium, initial pH, fermentation temperature and fermentation time were analyzed and the fermentation process was optimized by one-factor-at-a-time design (OFAT), fractional factorial design (FFD), central composite design (CCD) and response surface methodology. The optimal fermentation process conditions were 10 g of soybean dregs contained in a 250 mL shake flask with the addition of 2.33% peptone (g/g soybean dregs), 0.57% KH2PO4, 0.2% CaCl2 and 0.2% Tween-80 as the nutrient supplements, initial water content of 56.7%, fermentation temperature of 25 ℃ and fermentation time of 80 h. Under these conditions, the yield of SDF could reach up to 42.2%. Therefore, Mucor fermentation is applicable for the preparation of SDF from soybean dregs.

soluble dietary fiber；soybean dregs；Mucor；fermentation；preparation

TS209

A

1002-6630(2012)15-0210-06

2011-06-23

廣東省自然科學基金項目(9452404801001943)；湛江師范學院基金項目(ZL0912)

潘進權(1978—)，男，講師，博士，研究方向為酶與發酵工程。E-mail:pjq78@tom.com