枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學性質

王 剛，郭明珠，陳 光,*

枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學性質

王 剛1，郭明珠2，陳 光1,*

(1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.長春職業技術學院，吉林 長春 130033)

利用30%～70%飽和度的硫酸銨沉淀，Sephadex G-50凝膠過濾層析對淺盤發酵納豆激酶進行分離純化并對其酶學性質進行初步研究。以纖維平板法測定納豆激酶活力，SDS-PAGE檢驗純化效果。結果表明:純化后納豆激酶為電泳純，分子質量約27.518kD，純化倍數和酶活回收率分別為19和42.1%，納豆激酶最適溫度為50℃，最適宜pH值為8.0。

納豆激酶；枯草芽孢桿菌；純化；酶學特性

心腦血管血栓是心腦血管的大病，全球每年腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化等心腦血管疾病奪走1200萬人的生命，接近世界總死亡人數的1/4，成為人類健康的頭號大敵。典型的以溶栓治療為目的的藥物包括尿激酶和組織型纖溶酶原激活物(TPA)。這些藥物存在價格昂貴，在體內半衰期短等缺點。納豆激酶(nattokinase)是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，來源于日本納豆[1-2]、海洋生物[3]、天培[4-5]、豆豉[6-7]等。納豆激酶具有易于提取，溶栓效果好，成本低廉，來源于食品，無任何毒副作用。近年來，各國學者對納豆激酶開展了廣泛的研究，包括菌種分離[8-9]，納豆激酶的發酵條件優化[10-12]，分離提取[13]，功能及結構分析[11-12,14-16]等。 Fujita等[17]的研究表明，與纖溶酶相比，納豆激酶對纖維蛋白本身更敏感，直接破壞交聯纖維蛋白，而不是破壞體內的纖維蛋白原。更重要的是納豆激酶可以由消化道吸收到血液中而引起溶血栓作用[18]。因此，納豆激酶在溶栓藥物和保健食品開發方面，具有極其重要的意義，為獲得更好的溶栓、抗栓效果，實驗以Sephadex G-50排阻層析對納豆粗提物進行分離純化，以SDS-PAGE檢驗純化效果，并進行酶學性質的初步研究，以期為納豆激酶保健品及納豆激酶抗栓制劑的研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

納豆菌NK-1由吉林農業大學生物工程實驗室提供；纖維蛋白原、標準尿激酶(1280U/支) 中國藥品生物制品檢定所；凝血酶(2000U/支) 浙江杭康海洋生物藥業公司；瓊脂糖(進口分裝) 寶泰克生物制品有限公司；其他試劑均為國產分析純。

斜面培養基:蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%、種子培養基:葡萄糖1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%，調節pH＝7；淺盤發酵培養基:浸泡過夜大豆50g、麥芽糖0.1%、半乳糖0.1%、起始含水量50%。

1.2 儀器與設備

GD751分光光度計 上海雷韻試驗儀器制造有限公司；Sartorius BS210S電子分析天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；1-6p高速冷凍離心機 美國Sigma公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌鍋 日本ALP公司；722紫外-可見分光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淺盤發酵及納豆激酶粗提液制備

將市售大豆清洗除雜，2.5～3倍的清水浸泡過夜，瀝去水分，121℃滅菌30min，降溫至50～60℃時，接入納豆菌，37℃恒溫靜置培養24h，4℃冰箱中后熟24h。用生理鹽水浸提納豆中的有效成分，經過10000r/min冷凍離心，取上清，即為粗酶液。

1.3.2 納豆激酶活性測定方法

1.3.2.1 纖維蛋白平板制備

參照Astrup等[19]的方法，并進行了一定的改進:稱取瓊脂糖0.5g，溶于4mL 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，沸水浴煮沸，使其完全融化。設其為Q；另稱取纖維蛋白原11mg，溶于5mL 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，45℃溫浴，設其為F；稱取凝血酶10U，溶于1mL 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，45℃溫浴，設其為T。當Q溫度降為50℃左右時，把Q倒入T中，然后倒入F，迅速混勻，防止氣泡的產生，倒平板。每平板打孔5～6個，點樣品，37℃培養16h。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

在纖維蛋白平板上以打孔器打5個孔，每孔內加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)10μL。將稀釋好的標準品尿激酶(1U/mL)依次加入5個孔中，體積分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL，混勻，37℃保溫16～18h。用游標卡尺測量每個溶菌圈的直徑，然后以溶菌圈面積(cm2)為縱坐標，以標準尿激酶活力(U)為橫坐標作標準曲線，得標準方程為y＝3.2782x(R2＝0.9641)。

1.3.2.3 納豆激酶活力

納豆中加入200mL生理鹽水浸提1h，3000r/min離心10min，取上清液，稀釋點樣于纖維蛋白平板，根據標準曲線計算出納豆激酶相對于尿激酶的活力。

1.3.3 硫酸銨鹽析

采用硫酸銨鹽析，取硫酸銨的飽和度分別為10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%，靜置過夜后，離心。分別測定上清和沉淀中的納豆激酶酶活力。

1.3.4 柱層析分離納豆激酶

采用葡聚糖凝膠Sephadex G-50對鹽析后的樣品進行進一步分離。柱層析的條件為:柱長:100cm；柱徑: 1cm；柱溫:室溫；上樣量:1mL；檢測波長:254nm；流速:0.5mL/min；洗脫液:pH8.0 10mmol/L Tris-HCl緩沖液(含2mmol/L CaCl2)。

1.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測

SDS-PAGE不連續凝膠電泳[20-21]。

1.3.6 蛋白質含量測定

以Bradford法[22]測定蛋白含量，采用牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.3.7 pH值對納豆激酶活力的影響

將納豆激酶溶于各種不同梯度的pH值緩沖液中(pH4～7:檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH8～11:廣泛緩沖液)，以纖維蛋白平板法測定酶活力，以最適條件下的酶活力(即最高值)為100%。

1.3.8 溫度對納豆激酶活力的影響

在不同溫度(25、30、37、40、45、50、55、60℃)條件下保溫16h，以纖維蛋白平板發測酶活力，以最適條件下的酶活力(即最高值)為100%。

2 結果與分析

2.1 納豆激酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析結果

圖1 硫酸銨飽和度對納豆激酶酶活力的影響Fig.1 Effect of degree of ammonium sulfate saturation on the precipitation of nattokinase

由圖1可知，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，納豆激酶逐漸的轉移到沉淀當中。硫酸銨飽和度在0～30%時，納豆激酶大部分存在于上清液當中，沉淀中的蛋白大部分為雜蛋白，可以除去，因此選擇去除雜蛋白的硫酸銨飽和度為30%。當硫酸銨的飽和度為70%時，納豆激酶大部分轉移到沉淀中，硫酸銨飽和度繼續增加時，沉淀中納豆激酶酶活不再上升，因此，本實驗中選擇沉淀納豆激酶的硫酸銨飽和度為70%。

2.1.2 Sephadex G-50柱層析分離納豆激酶

圖2 葡聚糖凝膠Sephadex G-50的分離圖譜Fig.2 Elution profile of Bacillus subtilis nattokinase on Sephadex G-50 column

由圖2可知，經葡聚糖凝膠Sephedex G-50分離之后，得到4個吸收峰，其中吸收峰1和吸收峰3的濃度較大，吸收峰2和吸收峰4的濃度較小，其分離效果不很明顯。將4個組分收集并分別經纖維蛋白平板法測納豆激酶酶活，吸收峰3為目的吸收峰。

2.1.3 納豆激酶分離結果的電泳檢測

葡聚糖凝膠層析分離后的組分，經SDS-PAGE對目標組分進行檢測，結果如圖3所示。

圖3 納豆激酶分離組分的電泳檢測Fig.3 SDS-PAGE of purified nattokinase

由圖3可知，經過Sephadex G-50柱層析后的納豆激酶顯示為一條帶，表明分離效果較好。同時以已知標準蛋白分子質量的對數(1gMr)為縱坐標，相對遷移率為橫坐標繪圖，其回歸方程為y＝－1.055x＋5.2197 (R2＝0.9574)。按此方程計算，納豆激酶的分子質量為27518D，與相關文獻[23-24]報道接近。

2.1.4 純化過程評價

表1 分離純化結果Table 1 Protein purity, total and specific kinase activity of isolate at different stages of purification

在純化納豆激酶的整個過程中，需要對每個步驟進行測定評價，即對純化過程的每一步收集的酶液進行有效(有活性)成分含量的測定，并計算酶比活力、總酶活力、純化倍數和回收率，結果如表1所示。純化過程中總蛋白、總酶活力呈逐漸降低的趨勢，但其酶比活力、純化倍數逐漸增高。經Sephadex G-50層析后，純化倍數為19，回收率為42.1%。

2.2 納豆激酶的酶學性質研究

2.2.1 納豆激酶的最適反應pH值

圖4 納豆激酶的最適pH值Fig.4 Effect of pH on the activity of Bacillus subtilis nattokinase

由圖4可知，隨著pH值的增加，納豆激酶活力呈先增加后降低的趨勢，當pH值為4時，納豆激酶相對酶活力僅38%，當pH值為8時，相對酶活力最高，pH7.0～9.0為最適反應pH值。

2.2.2 納豆激酶的最適反應溫度

圖5 溫度對納豆激酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of Bacillus subtilis nattokinase

由圖5可知，隨著溫度的升高，納豆激酶的相對酶活力，呈先增高后降低的趨勢，50℃時納豆激酶的相對酶活力最高；溫度降為室溫(25℃)時，納豆激酶的活力僅為30%。當溫度大于50℃，納豆激酶的活力開始逐漸降低。

3 討 論

3.1 納豆激酶的分離純化

分離純化是一個復雜的過程，在純化過程中，隨著純化倍數的提高，酶活性逐漸降低，得率也逐漸下降，但酶比活力是逐漸升高的。采用離心、鹽析、Sephadex G-50凝膠色譜法對納豆激酶發酵的粗提物進行純化，從發酵粗酶液到最后的Sephadex G-50柱層析，純化倍數為19倍，回收率為42.1%，全過程損失了57.9%，純化倍數與前人的研究[10,13,25-26]接近，略高于高大海等[27]的研究。

3.2 酶學性質的研究

酶蛋白分子上帶有很多酸性和堿性氨基酸殘基，pH值的變化會直接影響到這些殘基側鏈基團的解離狀態，進而影響酶與底物的結合能力、催化反應、酶的空間結構及酶的活性。由于酶是蛋白質，可隨溫度的升高而變性，因此酶促反應應有一個最適溫度，在此溫度下酶促反應速度最快。納豆激酶的最適反應溫度為50℃，與江曉等[28]的研究接近。與董志奎[24]、朱健輝等[29]的研究不同。最適反應pH值為8.6，與慕娟[30]、鮑艷霞等[31]的研究接近。

4 結 論

4.1 納豆激酶純化工藝為:納豆激酶粗提液離心，30%飽和度硫酸銨去除雜蛋白，70%飽和度硫酸銨沉淀納豆激酶，沉淀用10mmol/L pH6.4磷酸緩沖液溶解后，經Sephadex G-50凝膠層析，收集活性部分納豆激酶的純度很高，酶比活力為22388.81U/mg，SDS-PAGE電泳檢驗為單一條帶。最終的純化倍數為19，酶活回收率為42.1%

4.2 納豆激酶最適反應pH值為pH7.0～9.0，納豆激酶最適反應溫度為45～55℃。

4.3 該純化工藝適于實驗室高純度制備納豆激酶，以供進一步研究其溶栓機理。

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Purification and Characterization of Bacillus subtilis Nattokinase

WANG Gang1，GUO Ming-zhu2，CHEN Guang1,*
(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun 130033, China)

In this study, nattokinase produced by Bacillus subtilis NK-1 after shallow tray fermentation was separated and purified by 30%－70% saturation ammonium sulfate precipitation and Sephadex G-50 column chromatography and enzymatically characterized. Nattokinase activity was measured by fibrin plate method, and SDS-PAGE was used to analyze its purity. Electrophoresis-pure nattokinase was obtained, with a molecular weight of about 27.518kD. The purification factor and activity recovery were 19 and 42.1%, respectively. The optimal reaction temperature and pH of this enzyme were 50 ℃ and 8.0, respectively.

nattokinase；Bacillus subtilis；purification；characterization

Q815

A

1002-6630(2012)15-0231-04

2011-06-28

吉林省自然科學基金項目(201115189)；吉林農業大學青年啟動基金項目(201129)

王剛(1978—)，男，講師，博士研究生，研究方向為酶工程。E-mail:gangziccc@163.com

*通信作者:陳光(1961—)，女，教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail:chg61@163.com