黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸關鍵酶的分離純化

王貴珍，董 昕，文連奎

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸關鍵酶的分離純化

王貴珍，董 昕，文連奎*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

為得到黑曲霉菌株F1中具有降酸作用的蛋白，將黑曲霉菌株F1經酒石酸誘導發酵得到菌絲體，用液氮研磨破碎細胞壁，超聲波輔助提取得到粗酶液，硫酸魚精蛋白去除核酸，熱變除雜蛋白，聚乙二醇濃縮，透析脫鹽，DEAE-纖維素52陰離子交換層析，Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分子篩層析，最終得到該蛋白的單一組分，其純化倍數為14.32，并確定該酶為脫氫酶類。

黑曲霉；酒石酸降解酶；分離純化

酒石酸(tartaric acid)，又名葡萄酸、二羥基琥珀酸，化學性質較穩定，廣泛存在于高等植物中，葡萄和羅望子(酸角)中含量較高。山葡萄中酒石酸含量占總有機酸的60%以上，對山葡萄酒的口感和品質具有較大影響[1-3]。在某些食品工廠廢液中也含有酒石酸，降解酒石酸對生產優質山葡萄酒、凈化含酒石酸的廢水有著非常重要的意義。

目前，降酸的方法主要有物理、化學和生物法[4-6]。而生物法降酸則主要集中在蘋果酸的降解方面[7-10]，生物降解酒石酸的報道很少。國外研究者發現了一種能降解酒石酸的假單胞菌微生物，并且對該過程中涉及到的一系列酶進行了分離純化[11-12]。

筆者所在實驗室從富含酒石酸的環境中篩選到一株能降解酒石酸的黑曲霉菌株F1，酒石酸降解率高達97%。本實驗進一步對其降解酒石酸的關鍵酶進行分離純化，以探究其降酸的機理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

黑曲霉(Aspergillius niger)F1由吉林農業大學食品科學與工程學院農產品加工及貯藏工程實驗室篩選，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(CGMCC5025)。

1.1.2 培養基

黑曲霉活化培養基(察氏培養基):蔗糖30g、NaNO32g、K2HPO4·7H2O 1g、氯化鉀0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

誘導產酶培養基:L(＋)酒石酸5g、K2HPO4·7H2O 1g、氯化鉀0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸餾水1000mL，pH3.0。

1.1.3 試劑

硫酸魚精蛋白(分析純)、NAD＋(分析純) 上海索寶生物科技有限公司進口分裝； SephadexG-75、DEAE-cellulose 52 上?？笊锛夹g有限公司；甲叉雙丙烯酰胺(電泳純)、考馬斯亮藍G-250、R-250(分析純)、牛血清白蛋白(分析純) 中國惠世生化試劑有限公司進口分裝；四甲基乙二胺 國藥集團化學試劑有限公司；丙烯酰胺、β-巰基乙醇 北京鼎國生物技術有限公司；其他試劑均為分析純或化學純。

1.1.4 儀器與設備

JY92-II型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21LM型高速冷凍離心機 湖南星科科學儀器有限公司；SPX-250B-D型微電腦全溫振蕩培養箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠；YC-2型層析實驗冷柜、FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；DW-F190-40℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；HD-2000型核酸蛋白檢測儀 上海嘉鵬科技有限公司；T6型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 誘導產酶實驗

1.2.1.1 菌種活化

將－40℃保藏的菌種解凍后轉接到察氏斜面培養基中，32℃培養72h，進行活化培養。

1.2.1.2 菌懸液制備

將斜面培養基上生長的孢子輕輕刮下，懸浮到滅菌的生理鹽水中，置于搖床中振蕩打散。采用比濁法測定孢子數。

1.2.1.3 誘導產酶實驗

在500mL三角瓶裝入200mL液體產酶發酵培養基，121℃滅菌20min，接種黑曲霉孢子懸浮液，接種量1%，置于振蕩培養箱中培養，160r/min、32℃培養4d。

1.2.2 酒石酸降解酶的提取

粗酶液制備→硫酸魚精蛋白去除DNA→熱變→聚乙二醇濃縮→透析除鹽→DEAE纖維素52離子交換層析柱→SephadexG-75分子篩層析。其中每一步均測定酶活力和可溶性蛋白質含量。

1.2.2.1 菌絲體制備

將振蕩培養4d的黑曲霉細胞經循環水式真空泵抽濾，用蒸餾水多次洗滌直至細胞表面無培養基殘留，收集菌絲體，備用。

1.2.2.2 細胞提取物的制備

取上述菌絲體50g，放入已事先預冷的研缽中，傾入液氮快速充分研碎細胞，加入0.1mol/L pH7.0 Tris-HCl緩沖溶液200mL，該緩沖溶液中含0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇，將細胞混合物置于冰水浴中，160W超聲40min(每隔30s超聲一次，每次超聲時間30s)，在4℃、10000r/min條件下離心30min[13]，棄去細胞碎片，得上清液，即為細胞提取物，記錄上清液體積。

1.2.2.3 去除核酸

取上述細胞提取物置于冰水浴中，邊攪拌邊緩慢加入0.1倍體積的質量濃度為2g/100mL硫酸魚精蛋白[14]，在4℃、10000r/min離心30min，棄去沉淀，得上清液，記錄體積。

1.2.2.4 熱變去除雜蛋白

將得到的上清液在53℃恒溫水浴鍋中保溫10min[15]，保溫過程中不斷緩慢攪拌，取出后迅速置于冰水浴中，冷卻一段時間，再4℃、10000r/min離心30min，棄去沉淀，得上清液，記錄體積。

1.2.2.5 硫酸銨分級沉淀

將含有5mmol/L β-巰基乙醇的飽和中性硫酸銨溶液加入上述得到的上清液中，兩者的體積比為1.4:1[16]，在冰水浴中邊攪拌邊加入，4℃靜置2h。4℃、10000r/min離心30min，棄去上清液，收集沉淀，將其再次溶解到少量體積0.05mol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，該緩沖溶液中含0.4mmol/L MnCl2和1mmol/L β-巰基乙醇。得到黑曲霉酒石酸降解酶的粗提液。

1.2.2.6 透析脫鹽、濃縮

將得到的粗酶液裝入事先處理好的透析袋中，置于500mL相同緩沖液中透析5h，每隔100min更換一次透析緩沖液；將經透析后的粗酶液于－20℃預凍10h后置于冷凍干燥機中凍干，得黑曲霉酒石酸降解酶濃縮液。于－20℃保存，備用。

1.2.2.7 DEAE-纖維素52離子交換層析

將處理好的DEAE-纖維素52裝入離子交換層析柱中(1.5cm×28cm)，用0.05mol/L、pH7.0的緩沖液過夜平衡，平衡緩沖液中含有0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇。將得到的粗酶濃縮液上樣于平衡好的層析柱中，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的KCl平衡緩沖液配制溶液進行梯度洗脫，流速30mL/h，5mL/管進行收集[17]。測定出峰部分各管在280nm波長處吸光度和酶活力情況，合并有酶活力部分洗脫液，真空冷凍干燥濃縮。

1.2.2.8 Sephadex G-75凝膠層析

將溶脹好的Sephadex G-75葡聚糖凝膠灌入層析柱中(1.6cm×60cm)，用0.05mol/L、pH7.0的緩沖液過夜平衡，平衡緩沖液中含有0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇，用相同的緩沖溶液洗脫，流速12mL/h，5mL/管進行收集[18]。測定出峰部分各管在280nm處吸光度和酶活力情況，合并有酶活力部分洗脫液，真空冷凍干燥濃縮。

1.2.3 分析測定

1.2.3.1 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白質含量[19]:配制一系列質量濃度分別為10、20、40、60、80、100μg/mL的標準牛血清白蛋白溶液，在595nm波長處測其吸光度。

以標準牛血清白蛋白溶液質量濃度為橫坐標，不同質量濃度溶液對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得出標準曲線方程為:A595nm＝0.0038ρ＋0.0064，相關系數R2＝0.9982。式中:ρ為標準蛋白液質量濃度(μg/mL)，質量濃度范圍為0～100μg/mL。

1.2.3.2 酶活力測定

[20]，所獲得的降解酒石酸的蛋白酶為酒石酸脫氫酶類，該種酶類需要有NAD＋作為輔酶來實現對酒石酸的催化降解作用，其反應機理如下:

L(＋)酒石酸＋NAD＋草酸乙醇酸＋NADH＋H+

由上式可知，當有過量底物存在時，NAD+被還原的速度與酶活力成正比，酶活力越高，單位時間內產生的NADH就越多。NADH對340nm紫外線有較強吸收，NAD＋則無此能力，因此可通過測定反應體系在340nm處吸光度的變化來反映NADH的生成量，從而表示酶活力的大小。25℃條件下，每分鐘催化1μmol NAD＋轉化為NADH所消耗的酶量定義為一個酶活力單位，即IU。

酶活力反應體系包括:0.2mol/L Tris-HCl、pH8.6、1mmol/L β-巰基乙醇、0.4mmol/L MnCl2、10mmol/L L(＋)酒石酸、2mmol/L NAD＋。25℃條件下，向該酶活反應體系中加入適量酶，在340nm波長處每隔30s測定一次吸光度。并以蒸餾水代替底物，做空白實驗。

為了證明所獲得的目的蛋白是否為脫氫酶類:分別在該酶中不添加NAD＋和添加NAD+，于340nm波長處每隔30s測定一次吸光度，檢測兩種情況下是否有酶活。

2 結果與分析

2.1 粗酶液的獲得

菌絲體經破碎，超聲輔助提取獲得的粗酶液中含有一定量的蛋白，說明所要提取的目的蛋白存在于粗酶液中。

2.2 熱變去除雜蛋白結果

熱變之后，酶活力14.14IU，總蛋白、總酶活力都有所下降，酶比活力上升，熱變除去了一部分小分子質量的蛋白質，目的蛋白也有一定損失，造成酶活降低。

2.3 DEAE-纖維素52離子交換層析

圖1 DEAE-纖維素52離子交換層析結果Fig.1 Elution profile of crude enzyme on DEAE-52 column

由圖1可知，經DEAE-纖維素52洗脫主要得到4個蛋白峰，1個主蛋白峰(99～123mL處)和3個小蛋白峰(35～63mL、63～75mL、135～147mL處)，分別收集4種不同組分，逐管測定酶活力情況，發現酶活力峰與主蛋白峰基本重合，但是主蛋白峰前面有一較小雜蛋白峰，說明這兩種蛋白離子強度相近，仍需進一步分離，收集主蛋白峰部分樣液，真空冷凍干燥凍干，于－20℃保存，備用。

2.4 Sephadex G-75凝膠層析結果

圖2 Sephadex G-75凝膠層析結果Fig.2 Elution profile of on partially purified enzyme on Sephadex G-75 column

由圖2可知，樣液經過Sephadex G-75凝膠柱后，主要獲得2個蛋白峰(27～39 mL、54～90mL處)，分別收集這2個蛋白峰樣液，逐管測定酶活力，從54mL時開始出現酶活力，90mL時酶活力消失，酶活力峰與主蛋白峰重合。另外，2個蛋白峰有一定距離，由于Sephadex G-75凝膠是根據蛋白質的相對分子質量大小進行分離的，那么圖中兩種蛋白質相對分子質量大小有一定差異。所以此方法能夠較好分離目的蛋白與雜蛋白。收集主蛋白峰部分樣液，真空冷凍干燥，－20℃保存，備用。

2.5 不同方法所測酶活力結果

表1 添加NAD+和不添加NAD+的酶活力實驗結果Table 1 Results obtained for determination of enzyme activity in the presence and absence of NAD+

從表1可以看出，不添加NAD＋的一組實驗中吸光度沒有變化，表示沒有酶活力，而添加了NAD＋的一組實驗中吸光度逐漸變大，說明生成了NADH，表示有酶活力。NAD＋是脫氫酶的輔酶，催化脫氫酶脫去氫而本身被還原為NADH，表明獲得的目的蛋白酶為脫氫酶。

2.6 酶的分離純化結果

為得到可降解酒石酸的酶，進行了細胞破碎、熱變、DEAE-纖維素52層析、Sephadex G-75凝膠層析等純化步驟。收集各純化步驟得到的上清液，分別測定其總蛋白含量、酶總活力、酶比活力，結果見表2。

表2 黑曲霉中酒石酸降解酶的分離純化Table 2 Purification of tartaric acid degrading enzymes from Aspergillus niger

由表2可知，黑曲霉菌細胞經細胞破碎、熱變、離子交換層析、葡聚糖分子篩層析后，總蛋白含量變為2.61mg，表明細胞里的雜蛋白被除去，同時可降解酒石酸的酶也有損耗；酶總活力變為757.5IU表明可降解酒石酸的酶在提純過程中有損失；酶比活力變為289.69IU/mg，表明經過一系列純化步驟，獲得了可降解酒石酸的酶，最終得率為28.63%，純化倍數為14.32。

3 結 論

經過誘導產酶、液氮破碎、超聲輔助提取、硫酸魚精蛋白去除核酸、熱變除雜蛋白、DEAE-纖維素52離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析等一系列分離純化手段，最終獲得了黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸目的蛋白酶的單一組分，冷凍干燥之后為白色粉末，最終純化倍數為14.32，該酶在有NAD+存在的條件下才有降解酒石酸的作用，因此確定了該酶屬于脫氫酶類。

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Isolation and Purification of Key Tartaric Acid Degrading Enzyme from Aspergillus niger F1

WANG Gui-zhen，DONG Xin，WEN Lian-kui*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The purpose of this study was to prepare a key tartaric acid degrading enzyme from Aspergillus niger F1. Aspergillus niger F1 was cultured and the expression of tartaric acid degrading enzymes was induced by adding tartaric acid into the medium. Cultured mycelia of Aspergillus niger F1 were collected and homogenized in liquid nitrogen. Crude enzyme extract was obtained by ultrasonic assisted extraction, added with protamine sulfate for removing nucleic acids, denatured for removing unwanted proteins, concentrated by PEG treatment, dialyzed for desalting, and then purified by DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography to obtain a single component with a purification factor of 14.32. The enzyme was proven to be a dehydrogenase.

Aspergillus niger；tartaric acid degrading enzymes；separation and purification

Q519

A

1002-6630(2012)15-0235-04

2011-09-23

吉林省科技支撐計劃項目(20090228)

王貴珍(1983—)，女，碩士，主要從事食品微生物及生物技術研究。E-mail:wangguizhen510@126.com

*通信作者:文連奎(1962—)，男，教授，博士，主要從事長白山野生資源的開發利用研究。E-mail:wenliankui@163.com